[发明专利]结核分枝杆菌海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2的表达纯化及与磷酸复合体的晶体三维结构

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂在大肠杆菌中的 表达、纯化、结晶优化方法以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂及其与磷酸根复 合体的晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选及药物设计方面的应 用。

背景技术

结核分枝杆菌的全球控制当今面临着重大挑战，WHO报道，目前世界 上二十多亿人口已感染结核分枝杆菌，造成每年近200万人口死亡。尤其是 非洲等出现的结核分枝杆菌和艾滋病毒的合并感染(结核/艾滋病毒)增加 了结核分枝杆菌的易感人群，以及在所有区域出现的耐多药(MDR)和广 泛耐药(XDR)结核病，使疾病控制活动更趋复杂、更为艰巨。

目前抗结核药物主要针对活性结核分枝杆菌，通过抑制其细胞壁，能 量ATP和DNA的合成，针对休眠期的药物靶点研究甚少。目前认为，结核 分枝杆菌细胞壁中的海藻糖是保护结核分枝杆菌度过干旱，炎热，缺氧等 极端环境的必需二糖。Mladen Tzvetkov等人在2003年发表文章认为结核分 枝杆菌体内有三条途径合成海藻糖，通过对每个途径中关键酶的基因敲出 实验证明OtsAB通路(将葡萄糖和葡萄糖六磷酸转化为海藻糖)是海藻糖 合成的至关重要的途径，对于结核分枝杆菌的生存具有不可缺失性,并且被 证明存在于多种细菌、酵母、真菌、昆虫和植物中。在这条通路中参与合 成海藻糖的酶有两种，一种是海藻糖-磷酸合成酶(trehalose-phosphate synthase,TPS or OtsA)另一种是海藻糖-磷酸磷酸酶(trehalose-phosphate phosphatase,TPP or OtsB)。OtsA主要用来催化将UDP-葡萄糖中的葡萄糖 基团转移到葡萄糖-6-磷酸中，产生海藻糖-6-磷酸和UDP，OtsB的功能是将 磷酸基团脱去产生海藻糖。在OtsB基因的同源片段中，只有OtsB₂具有生理 功能。OtsB₂即海藻糖-6-磷酸磷酸酶，被证明对于结核分枝杆菌的生长不可 缺失，并且在哺乳动物和人中不存在同源基因，是一种理想的药物靶点。

目前通过解析靶点蛋白质结构，可以对开展针对性的药物设计有重要 帮助，因此揭示结核杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂对展开药物设计以及功 能研究具有重价值。另外，以往研究中结核杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂未见报导在细菌中获得表达纯化和结晶，能够获得细菌表达纯化的蛋白结 晶对进一步研究海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的功能以及开展药物筛选工作 具有重要帮助，可以大大节约时间以及大大降低工作成本和劳动强度。

发明内容

本发明涉及结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的表达、纯化和结 晶优化方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂硒代蛋白质的载体构建、表达 和纯化方法，具体地说就是将29位和133位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，在大 肠杆菌Bl21(DE3)中使用特殊培养基大量表达硒代蛋白OtsB₂；以及海藻糖 -6-磷酸磷酸酶OtsB₂与磷酸根的复合体的结晶方法；以及海藻糖-6-磷酸磷 酸酶OtsB₂与磷酸根的复合体晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选 及药物设计方面的应用。

第一方面，本发明提供了一种在原核表达体系中，构建可溶性表达载 体的方法。其中所述标签蛋白选自His、GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、 特异性抗体，优选地使用His标签，其他标签均不能得到可溶性表达蛋白； 所述载体含有卡那霉素选择性标记基因。本发明优选使用大肠杆菌的原核 表达体系(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌中或者使用其他的真 核生物细胞进行表达)对目的蛋白以His融合蛋白的方式进行表达。