[发明专利]结核分枝杆菌海藻糖‑6‑磷酸磷酸酶OtsB2的表达纯化及与磷酸复合体的晶体三维结构

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的晶体或所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂与磷酸根复合体的晶体，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第29和133位突变为甲硫氨酸后的氨基酸序列，且所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的晶体具有P2(1)2(1)2(1)的空间群，晶胞参数为:a＝42埃，b＝89埃，c＝105埃，α＝β＝γ＝90°，所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂与磷酸根复合体为所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂与一个游离磷酸根结合的复合体，所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂与所述磷酸根的相互作用如图2中的C。

2.表达和纯化结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的方法，包括:

(a)构建融合了标签蛋白基因的编码结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂基因序列的载体，将重组载体转化入原核或真核细胞，进而表达带有标签蛋白的海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂，其中，所述标签蛋白选自His、GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、特异性抗体，所述载体含有卡那霉素选择性标记基因；

(b)将(a)获得的OtsB₂蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出所述目的蛋白，经过Thrombin蛋白酶在4-30摄氏度透析酶切过夜，其中透析缓冲液使用pH8.0的20Mm Tris，100mM NaCl，1mM DTT(二硫苏糖醇)，进一步将蛋白经过一系列亲和层析柱的方法进行纯化，通过丙烯酰胺凝胶的方法检测蛋白质纯度，得到纯化好的OtsB₂蛋白，所述亲和层析柱用Resource Q离子交换层析、反挂Ni-NTA亲和层析柱、凝胶排阻层析，其中反挂Ni-NTA亲和层析柱时，补充加入NaCl至终浓度300-500mM，并且通过浓缩的方法除去DTT(二硫苏糖醇)，其中，所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第29和133位突变为甲硫氨酸后的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的表达纯化结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的方法，其中步骤(b)中所述透析酶切温度使用4-10摄氏度。

4.根据权利要求2所述的表达纯化结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

5.结晶结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的方法，包括：

(a)将表达纯化好的结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂蛋白浓缩至浓度为10－20mg/mL，并且补加DTT至终浓度10mM；

(b)在20％PEG3350,200mM甲酸铵的条件下用气相悬滴法生长晶体；

(c)通过seeding方法对所述晶体进行优化；

(d)获得结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂的晶体,其中，所述结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB₂蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第29和133位突变为甲硫氨酸后的氨基酸序列,且所述的晶体具有P2(1)2(1)2(1)的空间群，晶胞参数为:a＝42埃，b＝89埃，c＝105埃，α＝β＝γ＝90°。