[发明专利]克里米亚-刚果出血热病毒CCHFV重组核蛋白NP的表达纯化及晶体结构

说明书

技术领域

本发明涉及克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白CCHFV NP(以下简称为CCHFV NP)在细菌中的高效表达，蛋白纯化、结晶方法以及CCHFV NP从第1位到第482位三维晶体结构。 

背景技术

克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever)是欧、亚、非三大洲都有分布的蜱媒自然疫源性病毒疾病。人群普遍易感，感染发病以青壮年为多，但也有2.5～3岁婴幼儿被感染。临床表现与其他型出血热相似，惟肾脏的损伤较为轻微。患者入院时多呈重症，病死率高达80％。本病因在克里米亚和刚果相继发现而得名。在国内首先发现于新疆巴楚，故我国又称新疆出血热。症状：起病急骤，恶寒战栗，体温上升至39～41℃。头痛剧烈，尤以前额和颞部剧痛难忍，颜面呈痛苦表情。周身肌痛，四肢关节酸痛剧烈，甚至难以行走。 

克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)属于布尼亚(布尼奥罗)病毒科(Bunyaviridae)的内罗病毒属(Nairovirus)。病毒颗粒呈圆形和椭圆形，直径约85～120nm，外被包膜。光学镜下在鼠脑的感染组织中可见到吉姆萨染色呈嗜碱性的有如红细胞大小的胞质包涵体，而在电镜下的超薄切片中可辨认包涵体所集聚的核糖体样致密颗粒，这些可能是抗原或病毒亚单位结构。成熟的病毒颗粒是从核周围的高尔基体囊泡壁上芽生出来的，分子量为(3.26±0.46)～108，蔗糖浮密度为1.16～1.18g/cm³。该病毒对温度的变化以及酸和乙醚均甚敏感，56℃环境中30min可完全灭活，置于普通冰箱中4℃、24h，可使感染滴度明显下降。 

CCHFV NP是由克里米亚-刚果出血热病毒S段基因编码的一种蛋白， 它是由482个氨基酸组成，分子量是54000道尔顿。它与病毒基因组RNA形成核糖核蛋白复合物，在RNA复制过程中起着至关重要的作用，已经成为研究抗体的理想抗原，此外它还有金属依赖性特异性切割DNA的内切酶活性，它在病毒生命周期中发挥重要作用。 

已知蛋白质三维结构将对开展有针对性的药物设计具有重要帮助，因此揭示CCHFV NP三维结构对开展药物设计和药物筛选及功能研究都具有重要价值。 

发明内容

本发明的一个方面是提供了一种将克里米亚-刚果出血热核蛋白NP进行基因工程改造，以提高其在大肠杆菌中能够得到高效表达。本发明优选使用大肠杆菌的原核表达系统表达(不排斥其他表达系统)，对上述蛋白以GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白的方式进行表达，并用于蛋白质结晶的方法。本发明涉及在大肠杆菌中高效获得核蛋白NP的表达方法。 

第二个方面，本发明提供了一种纯化核蛋白NP的方法。将基因工程方法改造过以后的NP基因连接于带有标签的表达性质载体中，转化进入大肠杆菌中进行表达、纯化。 

优选地，其中所述的标签选自GST、Flag-tag、MBP-tag、His-tag；所述载体含有选择性标记基因。所述与特异标签识别的方法是通过亲和层析柱进行，所述去掉标签的方法通过用蛋白酶酶解，所述分离纯化蛋白的方法是进一步用凝胶过滤和离子交换层析等方法分离纯化核蛋白NP；用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度。 

第三个方面，本发明提供了一种结晶上述得到的核蛋白NP的方法，所述的方法包括：将核蛋白NP浓缩至7-8mg/ml，在4-30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。 

第四个方面，本发明提供了衍射性能良好的CCHFV-NP蛋白质晶体。