[发明专利]克里米亚-刚果出血热病毒CCHFV重组核蛋白NP的表达纯化及晶体结构

权利要求书

1.一种克里米亚-刚果出血热(CCHFV)病毒核蛋白NP的晶体结构，其中，所述的核蛋白NP为所述核蛋白NP的全长从第1位氨基酸到第482位氨基酸组成。其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少一部分的原子坐标、或者任何与该坐标中至少40％氨基酸残基的主链碳骨架原子三维坐标的平均根方差小于等于1.7埃的结构。

2.根据权利要求1所述的CCHFV NP的晶体结构，其中所述的母体晶体具有优选的，其中所述的CCHFV NP的晶体具有P2(1)2(1)2(1)的空间群，晶胞参数约为：a＝58埃，b＝68埃，c＝131埃，α＝β＝γ＝90°。

3.根据权利要求1所述的CCHFV NP由23个α螺旋所组成，即其中α螺旋1，即含Lys10-Asn24氨基酸区段，α螺旋2，即含Asp44-Ala51氨基酸区段，α螺旋3，即含Asp60-Lys72氨基酸区段，α螺旋4，即含Ile77-Ser84氨基酸区段，α螺旋5，即含Thr86-Lys98氨基酸区段，α螺旋6，即含Ala100-Lys104氨基酸区段，α螺旋7，即含Asp107-Val115氨基酸区段，α螺旋8，即含Ile120-Ile137氨基酸区段，α螺旋9，即含Ile162-Asn178氨基酸区段，α螺旋10，即含Try200-Lys206氨基酸区段，α螺旋11，即含Ile210-Phe213氨基酸区段，α螺旋12，即含Ala229-Glu240氨基酸区段，α螺旋13，即含Val246-Lys263氨基酸区段，α螺旋14，即含Lys270-Ala302氨基酸区段，α螺旋15，即含Thr306-Ala317氨基酸区段，α螺旋16，即含Pro321-Lys336氨基酸区段，α螺旋17，即含Thr341-Ser350氨基酸区段，α螺旋18，即含Lys354-Leu362氨基酸区段，α螺旋19，即含Ala382-Gly393氨基酸区段，α螺旋20，即含Pro400-Gln405氨基酸区段，α螺旋21，即含Thr410-Asn415氨基酸区段，α螺旋22，即含Cys426-Gly440氨基酸区段，α螺旋23，即含Ala450-Val460氨基酸区段。其中，CCHFV NP整体上呈现出一个类似于网球拍式的立体结构。由α螺旋1到α螺旋9以及α螺旋15到α螺旋23组成网球拍的头部，有α螺旋10到α螺旋14组成网球拍的把柄部分。其中，从Leu180-Ser194的氨基酸区段由于蛋白本身在此区域有着较强的柔性(flexibility)，因此无法在三维晶体结构中获得。

4.根据权利要求1-3所述的CCHFV NP的晶体结构，其中所述的NP具有DNA特异性的核酸内切酶活性，活性中心主要由α螺旋3、α螺旋14、α螺旋15、α螺旋19、α螺旋21、α螺旋22和α螺旋23上的部分氨基酸残基构成。其中α螺旋15上的氨基酸残基Arg289、α螺旋19上的氨基酸残基Arg384、α螺旋23上的氨基酸残基His453和Gln457、α螺旋21上的氨基酸残基Lys411、α螺旋19上的氨基酸残基Glu387以及loop区的氨基酸残基Tyr374。

5.根据权利要求1-3所述的CCHFV NP的晶体结构，其中所述的NP晶体中存在大面积正电氨基酸聚集区域，功能为与RNA结合，形成RNA-NP复合物。RNA与NP结合的关键位点主要有Arg195、His197、Lys222、Arg225、Arg282、Lys286共6个氨基酸构成。

6.一种纯化CCHFV NP的方法，将权利1要求所述的CCHFV NP基因连接于带有标签的表达性质粒载体中，转化进入大肠杆菌细胞中进行表达、纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的标签选自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag、His-tag、特异性抗体，所述载体含有选择性标记基因。

8.一种结晶前述权利要求中任何一项所述的CCHFV NP蛋白的方法，所述的方法包括：将CCHFV NP蛋白浓缩至5-10mg/ml，在4-30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。

9.一种衍射性能良好的根据前述权利要求中任一项所述的CCHFV NP蛋白质晶体。