[发明专利]一种耐氧化性淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐一种耐氧化性淀粉酶突变体及其制备方法，具体涉及一种耐氧化性淀粉酶突变体及其制备方法。

背景技术

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)是一种降解淀粉的重要的工业用酶，主要应用在食品、纺织、医药、洗涤剂等领域。耐氧化性淀粉酶可用于纺织品退浆、洗涤剂添加剂以及以淀粉作粘结剂的粘度调节剂等。Horikoshi在1971年首先报道了产自嗜碱菌A-40-2的碱性淀粉酶。2007年Saxena等人筛选到一株可以产碱性淀粉酶的菌株。2010年Pancha等(Pancha I，Jain D，ShrivastavA，Mishra S，Shethia B，Mishra S，VP M，Jha B.A thermoactive[alpha]-amylase from a Bacillus sp.isolated from CSMCRI saltfarm.International Journal of Biological Macromolecules，2010，47(2)：288-291.)筛选出一株产耐温淀粉酶菌株。目前，国内的前处理酶制剂市场基本被丹麦诺维信公司和美国杰能科公司所垄断。诺维信公司介绍了一种淀粉酶，有较宽的pH及温度范围。具有耐化学氧化性的淀粉酶主要应用于洗涤剂添加剂和纺织退浆一浴法等工业中。但耐氧化性淀粉酶的工业化生产并没有报道。耐氧化性淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选、诱变和酶分子改造获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。诱变包括：自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。酶分子改造目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，达到耐氧化性的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耐氧化性淀粉酶突变体，在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中催化区域进行蛋氨酸的突变。

所述氨基酸的取代位点为淀粉酶催化区域周围暴露在酶表面的第307个氨基酸蛋氨酸位点。

所述氨基酸的取代位点为催化区域内四个蛋氨酸位点，分别为第135位，第204位，第219位，第237位。

能表达生产权利要求1-3任一所述淀粉酶突变体的载体也属于本发明要保护的范围。

能表达生产权利要求1-3任一所述淀粉酶突变体的细胞系或基因工程菌也属于本发明要保护的范围。

本发明要保护的另一个技术问题是提供一种制备所述淀粉酶突变的方法，其技术方案如下：

1)根据嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶序列(SEQ ID NO.1)，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAAQ(图1)；

2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；

3)通过对淀粉酶空间结构进行分析，确定催化区域内4个蛋氨酸残基(M135，M204，M219，M237)及催化区域附近酶分子表面一个蛋氨酸残基(Met307)(图2)；

4)针对已分析序列中不耐氧化的蛋氨酸位点(Met)设计引物，在引物中利用丝氨酸(Ser)的编码碱基序列替代蛋氨酸(Met)编码碱基，获得用于突变的引物(表1)；

5)利用设计的突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；

6)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得突变株。

7)测定突变株表达淀粉酶的耐氧化性。

本发明提供的淀粉酶突变体耐氧化性强，在500mM H₂O₂条件下40℃处理30min，酶活性残留由原来的18％提高至92％；相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该耐氧化淀粉酶突变体应用于纺织退浆、洗涤剂添加等领域，可以在强氧化环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：pAAQ的质粒图谱。

图2：淀粉酶3D空间结构。

图3：不同浓度H₂O₂处理对淀粉酶稳定性的影响。M135S；M204S；M219S；M237S；M307S；WT(突变前)。