[发明专利]含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在很多发展中国家，养蚕业是农民经济收入的一个重要来源。但是，每当养蚕业遭遇病毒侵害时，蚕业生产必将受到不可挽回的巨大损失。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是对养蚕业危害最为严重的一种病原。已有研究结果表明，破坏病毒的某些必需基因，病毒将不能进行增殖。利用转基因技术抑制病毒关键基因的表达是培育家蚕抗病品种的有效策略。

RNA干扰（RNAi）是指通过反义RNA和正链RNA形成双链RNA（dsRNA）分子，在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默，即序列特异性的转录后基因沉默技术。RNA干扰是最近十年发展起来的操控基因表达的新的强有力的实验方法。因为RNA干扰技术利用了dsRNA 能够特异的介导靶标基因表达沉默这一在生物界本身存在的基因表达调节机制，故与其他调控基因表达的手段相比，具有高效、快速且特异性好的特点。此外，由于RNA干扰是生物体固有的古老而天然的抗病毒机制，所以RNA干扰技术用于抗病毒治疗是最直接的运用。

利用转基因和RNA干扰相结合的转基因干扰技术，构建转基因干扰载体，在转基因家蚕体内持续表达能够抑制BmNPV病毒增殖的dsRNA，是制备家蚕抗病毒品种的有效方法。目前已有研究者利用IE1或者A4等组成型启动子来构建转基因干扰载体，制备转基因家蚕系统。但是，不管是否有病毒侵染，这些转基因家蚕系统体内都会有等量的dsRNA存在。因此，最优的转基因干扰载体应该是，制备的转基因家蚕在正常情况下有适量的dsRNA表达，在病毒侵染以后，家蚕体内的dsRNA量随着病毒侵入而诱导上调表达。

目前已经报道的少量关于家蚕转基因干扰抗BmNPV的研究中，都是利用组成性启动子构建转基因干扰载体，通过注射实验室用非滞育品种制备转基因家蚕系统。目前还没有利用组成诱导型启动子构建转基因干扰载体，制备家蚕实用品种转基因干扰系统的报道。

 

发明内容

     本发明的目的之一在于提供增强子Hr3联合启动子IE1的应用，该应用为家蚕转基因干扰载体的构建提供了新思路。本发明的目的之二在于提供一种转基因干扰载体，其能提高滞育家蚕品种对BmNPV病毒的抗性。本发明的目的之三在于提供上述转基因干扰载体的制备方法，该方法操作简单，稳定性高。

本发明家蚕转基因干扰载体的优化方法及其应用，依次通过以下步骤实现： 

(1)利用转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]构建包含病毒IE1启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm] (pb-IGG)，包含家蚕A4启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm] (pb-AGG)和包含病毒Hr3增强子、IE1启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm] (pb-HIGG)。

(2)将家蚕932品种通过15℃低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后2h-3h用显微注射仪内将3-4nl、总浓度为400ng/ul的混合质粒（增量表达载体和辅助质粒按1:1混合）注射进蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住。

(3)将完成注射的蚕卵在35%的甲醛蒸汽中消毒4min后,置于25℃、相对湿度为80%的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代（G0）的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的G1代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因个体单蛾区正常饲养，继代扩大群体数量。

(4)将转基因系统IGG、 HIGG、AGG和正常932（非转基因932）经口添食感染BmNPV病毒，设置不添食的转基因和正常932对照，连续10天统计死亡率。不同剂量病毒添食后的死亡率统计结果显示转基因系统HIGG对BmNPV病毒的抗性效果最好。