[发明专利]含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.增强子Hr3和启动子IE1在制备转基因干扰载体中的联合应用，所述增强子Hr3如SEQ ID NO:1的核苷酸序列所示，所述启动子IE1如SEQ ID NO:2的核苷酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的联合应用，其特征在于：所述转基因干扰载体为以BmNPV病毒为靶标的干扰载体。

3.含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体，其特征在于：所述转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]，所述基础载体上依次含有增强子Hr3、启动子IE1、目的基因正向片段、单链区、目的基因反向片段和终止信号序列SV40。

4.根据权利要求3所述的转基因干扰载体，其特征在于：所述目的基因为gp64基因，gp64基因的正向片段如SEQ ID NO:3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示。

5.根据权利要求4所述的转基因干扰载体，其特征在于：所述转基因干扰载体为pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]，转基因干扰载体以转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]为基础载体，并依次含有病毒Hr3增强子、IE1启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段。

6. 权利要求3所述的转基因干扰载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A．目的基因的正、反向片段的构建

设计目的基因正向片段，其上游引物为  5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3'，其下游引物为:  5' cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3'；设计目的基因反向片段，其上游引物为:   5' cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3'，其下游引物为   5' tgctctagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc 3'；利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，分别得如SEQ ID NO:3所示的目的基因正向片段和如SEQ ID NO:4所示的目的基因反向片段；

B．pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A的构建

将所述目的基因正向片段用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，同时用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切包含A3 intron的pMD-19载体，连接酶切片段，得pMD-19-gp64S-A3intron载体；将所述目的基因反向片段和pMD-19-gp64S-A3intron载体分别用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切并连接，得到pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体；

C．1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体的构建

将含有IE1启动子和SV40终止信号的L4440载体和pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A分别用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切并连接，得L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5；将L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和pSLfa1180fa载体分别用SalⅠ和BglⅡ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体；

D．1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体的构建

将1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体和所述增强子Hr3分别用NcoⅠ进行单酶切，并连接，得1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

E． pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]载体的构建

用限制性内切酶AscⅠ分别酶切步骤D所得1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，得Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段；同时用内切酶AscⅠ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段；将Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接，得重组载体pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFP afm]。