[发明专利]一个基于纳米技术的PSA高敏感检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫酶联吸附技术的检测方法，具体的说，涉及一种大幅度提高免疫酶联吸附技术检测方法灵敏度的金纳米颗粒双标探针-PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增检测方法。

背景技术

免疫反应是免疫体系中各成员(抗原、免疫分子、免疫细胞、免疫组织)之间相互依赖，相互影响和相互作用的一种免疫学现象。基于抗原和抗体特异性反应建立起来的免疫分析方法是一种利用抗原、抗体之间高特异性的相互作用(即免疫反应)实现对血样或尿样中的抗原、抗体、激素、受体和小分子药物进行鉴定的一种分析方法。因此，免疫分析比一般化学分析的特异性和灵敏度要高，被广泛的应用于生命科学，分析科学及医学等领域。

酶免疫分析是将酶反应的高效性与免疫反应的特异性有机结合的标记免疫学技术。1966年，Engvall和Perlmann建立了酶免疫测定法，主要是利用免疫复合体上的酶活性将特定的底物催化，使该物质的特征吸收峰发生变化，用分光光度计进行测定，从而测得待测物的量。具有灵敏度较高，操作较简便的优点，是目前使用广泛的免疫分析方法。

酶免疫分析法包括酶联免疫吸附分析法、酶免疫试验法、竞争结合酶免疫分析法等，其中ELISA(酶联免疫吸附法)是酶免疫法中应用最为广泛的一种。

ELISA的工作原理基于抗原或抗体的固定以及抗原或抗体的酶标记。利用蛋白与固相载体表面活性基团之间相互作用，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性；同时，抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，此种酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，待测样品与固相载体表面的抗原或抗体发生反应，经过洗涤后，加入酶标记的抗原或抗体，通过免疫反应而结合在复合物上，使酶的量与待测样品的量呈一定的比例，即酶的多少反映待测样品的多少。再加入酶的反应底物后，底物被酶催化成为特征吸收峰与底物不同的产物，通过使用分光光度法，即可对产物进行定量检测。

但是，传统的ELISA检测，其结果非常容易受到一些因素的影响。比如显色时间和温度的控制会影响实验结果；缓冲液的选择也非常重要，因为有的缓冲液体系能够减少底色；目前的ELISA检测灵敏度在ng级，难以满足对于一些微量重要物质的检测要求。

纳米技术目前被广泛应用于化学，物理和生命科学等各个领域，推动生物分析的快速发展，其高灵敏度对疾病的早期诊断，治疗效果追踪，血液和食品的微量检测筛选以及跟踪疾病的复发情况等都是必不可少的。

其中，金纳米颗粒是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，因此也称胶体金。金颗粒大小多在1-100nm，所以又被称为纳米金。金纳米颗粒溶液的颜色随其直径大小和所处的化学环境的不同而呈现红色至紫色不同的颜色。一般来说，直径越大，颜色越深，所有的金纳米颗粒在510-550nm的可见光范围内都有特征吸收峰。金纳米颗粒2-5nm呈桔黄色，10-20nm呈酒红色，30-64nm呈深红色。小分子的金纳米颗粒基本上呈圆球形，30-80nm为偏心圆形。

由于金纳米颗粒的高电子密度、纳米级尺度、较高的吸光度，以及其良好的生物相容性优点，使其成为免疫学实验中重要的标记物，目前，已经是现代免疫学四大免疫标记技术之一。

将核酸连接在金纳米颗粒上，使其检测延伸到了核酸领域，通过核酸上的巯基修饰与金形成共价连接，再通过盐离子减弱核酸分子间的静电排斥作用，在金纳米颗粒表面得到高密度核酸分子，从而实现信号放大。

PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一核酸片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前传统的ELISA检测方法的灵敏度需要进一步提高的问题，提供一种大幅度提高ELISA检测灵敏度的技术。