[发明专利]一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶和ApxIIC双基因缺失株、其构建方法及应用，属于细菌基因工程技术领域。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。目前该病已在世界各国广泛流行，造成巨大的经济损失，成为国际公认的危害现代化养猪业的重要传染病之一。随着我国现代养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈爆发趋势，有的猪场的阳性率已达到70％以上，严重阻碍了我国养猪业的健康发展。

根据APP表面荚膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可将APP分为15个血清型，血清1型又分为1a和1b两个亚型，血清5型又分为5a和5b两个亚型。目前在我国已发现并分离到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多种血清型，主要流行的血清型为1、3、5和7型。

溶血素是APP最主要的毒力因子，也是最主要的保护性抗原。目前在APP所有的15个血清型中共发现了4种Apx毒素，分别为Apx I、Apx II、Apx III和ApxIV。APP不同的血清型产生不同的Apx毒素，其中血清7型含有Apx II和ApxIV。

Apx毒素操纵子的典型结构含有完整的CABD基因；其中，A基因编码Apx毒素结构蛋白，开始合成时没有毒素活性，C基因编码Apx毒素激活蛋白，负责对结构蛋白进行乙酰化激活，形成ApxC-ApxA复合体，毒素活性随之产生。B基因和D基因的编码蛋白形成跨膜通道，负责Apx毒素的转运和分泌。Apx I和Apx III操纵子有完整的CABD基因，而Apx II操纵子缺少B基因和D基因，其产物由Apx I的BD基因编码产物负责转运分泌到细胞外。

生物被膜(Biofilm)是在生物体内和非生物体表面集聚生长的由细菌及其产生的多糖蛋白复合物所形成的固定细菌群落，它是病原菌持续感染、产生耐药性和免疫逃逸的重要原因之一。APP长期潜伏于猪体内常常引起持续性感染，近年来获得的许多临床分离株具有多重耐药性，并且较普遍地能形成生物被膜，被认为在APP致病过程中发挥重要作用。

生物被膜的产生是一个高度复杂的、由多种基因调控的动态过程，这些基因涉及到细菌的黏附、新陈代谢、群体感应(quorum sensing)和应激反应(stress response)等。近年来对病原菌应激反应与感染性疾病的研究发现，ClpP蛋白酶这一应激蛋白是一种十分重要的毒力因子，它是ATP依赖的丝氨酸蛋白酶，调节着细菌对环境各种压力的适应(如热休克、营养缺陷、氧化应激等)，维持细菌的形态和毒力，使其在各种环境下得到保护。研究发现该基因的插入突变或缺失通常会降低细菌对不良因素的承受能力，菌体生长被破坏，存活力下降，并影响生物被膜形成，造成毒力减弱。目前虽然仅探索了少数病原菌ClpP蛋白酶的功能，但在揭示致病机理和疫苗研究中已经显示出极为重要的研究价值和疫苗应用前景。

目前应用的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型感染猪引起的临床症状并降低死亡率，但不能阻止肺部病变和慢性感染，对异源血清型的感染也不能提供很好的交叉保护，而自然感染或试验感染能够诱导对任何异源血清型的保护。因此，高效的弱毒疫苗的研制开发也许是解决当前胸膜肺炎疫苗的不足的一种可行方法。

鉴于上述背景，构建在我国流行的APP血清7型ClpP蛋白酶和Apx II C双基因缺失株，研究其遗传特性、生长特性、毒力、对动物的致病性和免疫原性等生物学特性，为猪传染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道传染病的药物研究以及疫苗研究奠定重要的基础。

发明内容

本发明的目的之一在于获得一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP和apx IIC双基因缺失株。

本发明提供的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP和apx II C双基因缺失株，是将猪胸膜肺炎放线杆菌的ClpP蛋白酶和溶血素激活因子Apx II C的编码基因灭活后得到的缺失株。