[发明专利]一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株，其特征在于：该菌株缺失了ClpP蛋白酶和Apx II C蛋白的编码基因。

2.如权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株，其特征在于：所述ClpP蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，Apx II C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种构建权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通过将DNA片段ΔclpP以及Δapx II C导入所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株经同源重组后实现的；

所述DNA片段ΔclpP从上游至下游依次为上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX：所述上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的ClpP蛋白酶编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，灭活所述ClpP蛋白酶的编码基因，得到clpP单基因缺失株APPΔclpP；

所述DNA片段Δapx II C从上游至下游依次为上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX，所述上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的Apx II C蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述Apx II C蛋白的编码基因，得到clpP和apx II C双基因缺失株APPΔclpPΔapx II C。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述ClpP蛋白酶的编码基因如SEQID NO.1所示，所述的Apx II C蛋白的编码基因如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于扩增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示：

clpSF：5’-CG(EcoR I)GGGGCGTTACTGGATGC-3’

clpSR：5’-CCATCGCTTCGGTTTGC-3’

扩增下同源臂ClpPX的引物序列如下：

clpXF：5’-TCCAAAGGCGAATACGGTC-3’

clpXR：5’-CG(BamH I)TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3’

扩增上同源臂apx II CS的引物序列如下：

II CSF：5’-CG(EcoR I)ATGACAACACCAATGATTGATTTAC-3’

II CSR：5’-AATCCCCGAACTCCCATTC-3’

扩增下同源臂apx II CX的引物序列如下：

II CXF：5’-GGATGATGCTCATCTCTATTG-3’

II CXR：5’-CG(BamH I)GTTGTAATAAGTCCCGTAACACCAG-3’

所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株为APP血清7型CVCC265株。

6.如权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株，其特征在于所述的基因缺失株为APPΔclpPΔapx II C，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.5444。

7.权利要求1、2或6中任一项所述的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株在制备预防猪传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。

8.一种猪传染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分为权利要求1、2或6中任一项所述的猪胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株。