[发明专利]一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途

说明书

技术领域：

本发明涉及一种预防或治疗人类的肠道传染病生物新药的制备以及开发，特别是一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途。

背景技术：

近年来，国外已有报道证实当用病毒作抗原免疫产蛋母鸡时，蛋黄中能产生相应的抗该病毒的特异性多克隆卵黄免疫球蛋白(IgY)，且产量大，便于提纯，尤其卵黄免疫球蛋白稳定性好，其耐酸碱和热能力与免疫球蛋白(IgG)相似，能抵抗幼龄动物的胃酸屏障，卵黄免疫球蛋白可使实验动物获得对应病原体引起的胃肠道感染性疾病的免疫保护作用。因此，可用于防治经胃肠道感染的病毒性疾病，如轮状病毒引起的婴幼儿秋冬腹泻。并且，引起消化道感染性疾病的病原体大多分布在消化道粘膜表面，而卵黄免疫球蛋白抗体大部分经过消化道代谢，只有很少的一部分被吸收入血。因此，抗原特异性的卵黄免疫球蛋白有利于消化道局部大量病原体特异性的抗体，从而大大地提高治疗效果。在胃肠道感染性疾病治疗上有广阔的应用前景，引起了广泛的关注。IgY在食品、医药、生物等方面的应用越来越广泛.其作用机理逐渐被阐明和完善。IgY已被证明能有效替代抗生素预防和治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽门螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。

卵黄作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如：母鸡易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便，无需抽动物血，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。

在免疫治疗方面，因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳定，可经用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病，如婴儿防病食品等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时，IgY成为首选。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种安全、可靠、经济简便、易于推广，适用面广的针对轮状病毒的卵黄IgY抗体缓释制剂及其制备方法与应用。

一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途，它是由人型轮状病毒为免疫原，牛型WC3株为病毒生产株，MA-104细胞为病毒培养宿主细胞，通过病毒培养，收获病毒液，经纯化、超滤浓缩获得原液，注射到SPF母鸡体内，经此免疫后，取鸡蛋卵黄经分离提取、纯化得到卵黄免疫球蛋白。再加入卵磷脂制成注射液。用于预防或治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽门螺杆菌等感染引起的胃肠道疾病。

所用人型轮状病毒为Wa株和猴型SA11株的二联体。

一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法：

(1)细胞培养

将MA-104细胞用旋转培养瓶连续传代培养，用胰蛋白酶处理细胞，加入病毒液，然后吸去病毒液，以维持液继续培养，至细胞病变达75％时收获病毒液。

(2)病毒培养液的纯化

病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎，离心，上清中加入PEG6000，放置过夜，离心，沉淀用PBS重悬，上样至Sepharose GL-4B进行凝胶过滤，收集主峰后超滤浓缩，浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。

(3)动物免疫

采用六月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡注射灭活双价病毒液+不完全福氏佐剂。待卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行卵黄免疫球蛋白提取。

(4)免疫鸡蛋的处理

免疫鸡蛋表面无菌处理，去蛋清后匀化处理，匀化后静置过夜。

(5)免疫球蛋白纯化

上清加入饱和硫酸铵梯度沉淀，静置，离心，沉淀用PBS重悬，经Sepharose 4FF柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰经超滤脱盐浓缩。

(6)制剂制备

加入卵磷脂制成注射液。

一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的用途：

(1)在疾病预防方面的应用

研究表明，IgY能抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。可以在动物饲料或婴幼儿食品添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的IgY，以使其获得有效的被动免疫。

(2)在疾病治疗方面的应用