[发明专利]一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法

说明书

技术领域

一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，属于分析化学领域，同时也涉及水环境污染物的检测技术领域。本发明设计先将样品氧化后经氯甲酸甲酯甲酯化反应，最后由氯仿萃取，对微囊藻毒素的总量进行测定。

背景技术

微囊藻毒素是一类具有生物活性的环状七肽毒素，具有肝脏毒性和肿瘤促进作用，它不仅对水生生物产生毒害作用，还可能通过饮用水和食物链的生物富集危害人类健康。世界各地由藻毒素引起的鸟类、鱼类、家畜中毒事件频繁发生，流行病学调查显示，在我国原发性肝癌与饮用水水源中微囊藻毒素的高本底含量相关。因此，世界卫生组织推荐的饮用水中藻毒素以MC-LR代表的标准值为1.0 μg/L。藻毒素毒性与MC-LR毒性相似，藻毒素种类繁多，已发现超过七十种。

目前微囊藻毒素的检测方法很多，化学分析检测包括薄层色谱法(TLC)，气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC-MS)，免疫检测有酶联免疫测定法(ELISA)及生物化学检测有蛋白磷酸酶抑制法。然而受到商品化标准品的限制，微囊藻毒素的定量检测往往限于常见三种MC-LR、MC-RR、MC-YR，不能真实地反映出微囊藻毒素总量。MMPB方法主要基于MC的氨基酸残基Adda的特殊化学性质，可以有效提供所有类型MC(包括结合和非结合)的总量，MMPB未在自然环境中发现，因而可用于定量检测MC。特别在毒性实验中，可以获得更加全面重要的信息。此前，藻毒素总量的测定是在一定条件下，MC分子中的共轭双键氧化生成MMPB，采用液相色谱法检测水中MMPB的含量，或将MMPB衍生化用气相色谱法检测，存在检测灵敏度不够的缺点。本发明主要提供了一种检测MMPB的新方法，较之前的方法操作更便捷。

微囊藻毒素总量测定，采用氯甲酸甲酯对氧化产物甲酯化后进行气相色谱-质谱联用分析的方法尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，首先浓缩样品并调节pH值至8.5-9.5，经高锰酸钾溶液氧化，用亚硫酸氢钠粉末终止反应并酸化，将氧化产物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸（MMPB）加入甲醇，以吡啶作为催化剂经氯甲酸甲酯甲酯化反应后由氯仿萃取，本方法用4-苯基丁酸作为内标物，并用气相色谱-质谱联用对甲酯化的MMPB进行检测。该方法能够有效检测微囊藻毒素的总量（以MMPB计），具有良好的灵敏度和重现性，得到的结果令人满意。

本发明的技术方案：一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，加入内标的样品经高锰酸钾与高碘酸钠氧化溶液氧化后终止反应，氧化产物经氯甲酸甲酯甲酯化反应后由氯仿萃取，并用气相色谱-质谱联用对甲酯化的MMPB进行检测。步骤为：

A、取100mL水样，加入100μL含1.0μg/mL 4-苯基丁酸水溶液作为内标，在40℃下减压浓缩至10mL；

B、取上述浓缩液0.50-2.00 mL，用0.50mol/L K2CO3水溶液调节pH值至8.5-9.5；

C、加入25-50μL的0.025 mol/L KMnO₄和饱和NaIO₄水溶液，反应60-120min；

D、加少量NaHSO₃粉末终止反应后，用10 mol/L H₂SO₄溶液酸化，再用氮吹仪浓缩至2mL；

E、取0.5mL上述浓缩液，加入200μL甲醇和50μL吡啶，摇匀；加入50μL氯甲酸甲酯，振荡1min；最后加入200μL氯仿，剧烈振荡后静置5 min，溶液分层，用微量进样针吸取底部的氯仿溶液直接进气相色谱-质谱分析；气相色谱-质谱分析条件为：

气相色谱条件：色谱柱：DB-WAX石英弹性毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；载气：He，纯度≥99.999%；流速：1mL/min；不分流进样，进样量1μL；进样口温度260℃；柱初始温度100℃，以15℃/min升至230℃，保持2min；

质谱条件：EI源；离子源温度200℃；传输线温度 250℃；发射电流200μA；检测器电压350V；电子能量：70eV；选择离子监测模式，目标化合物以保留时间和特征离子定性；根据峰面积计算微囊藻毒素总量(以MMPB计)的浓度。

MMPB和内标物4-苯基丁酸甲酯化产物的保留时间及监测离子见下表：