[发明专利]肝素酶I融合蛋白在审
| 申请号： | 201110418496.0 | 申请日： | 2011-12-15 |
| 公开（公告）号： | CN103160487A | 公开（公告）日： | 2013-06-19 |
| 发明（设计）人： | 曹林;杨翔;颜明 | 申请（专利权）人： | 曹林;杨翔;颜明 |
| 主分类号： | C12N9/88 | 分类号： | C12N9/88;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/20 |
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| 地址： | 210000 江苏省南京市*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肝素 融合 蛋白 | ||
1.一种肝素酶I融合蛋白，包含三个结构域：融合结构域、连接结构域和肝素酶I结构域，其特征在于：所述的融合结构域选自硫氧还蛋白(Trx)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)或翻译起始因子2(IF2)其中的一种，肝素酶I结构域为肝素黄杆菌肝素酶I。
2.含有权利要求1所述的肝素酶I融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述的硫氧还蛋白(Trx)的编码基因是(SEQ ID No.12)；小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)的编码基因是(SEQ ID No.13)；翻译起始因子2(IF2)的编码基因是(SEQ ID No.14)；所述的连接结构域的编码基因是(SEQ ID No.15)；并且所述的肝素黄杆菌肝素酶I的编码基因是(SEQ ID No.16)。
3.含有权利要求2所述的肝素酶I融合蛋白编码基因的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：表达载体为pFusion。
5.根据权利要求3所述表达载体的工程菌，其特征在于：工程菌为大肠杆菌。
6.一种表达肝素酶I融合蛋白的方法，其特征在于：将含有肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达得到肝素酶I融合蛋白。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于：表达载体为pFusion，所述的表达宿主菌为大肠杆菌。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于：所述肝素酶I融合蛋白的诱导表达条件为挑取单菌落至3ml LB培养基(含10μg/ml卡那霉素)，37℃培养至OD600＝0.5，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续在16℃培养12小时。
9.一种纯化肝素酶I融合蛋白的方法，其特征在于：Ni亲和层析的方法纯化。10,000g离心收集1L 16℃表达的菌体，用100ml PBS(50mM NaH2PO4 pH 8.0，300mM NaCl)重悬，超声破菌。裂解液在12,000g离心20分钟；上清通过预先用PBS(50mM NaH2PO4 pH 8.0，300mM NaCl)平衡的Ni-NTA agarose亲和层析柱(Qiagen)；肝素酶I融合蛋白用50mM NaH2PO4 pH 8.0，300mM NaCl，250mMimidazole洗脱。洗脱组分用20mM Tris-HCl，100mM NaCl在4℃透析过夜。
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