[发明专利]一种非连接依赖性的快速克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种快速克隆的方法。 

背景技术

连接酶依赖性的DNA定向克隆技术的建立是上世纪生物学领域中里程碑式的成就。这一技术的建立及应用使得人们可以在一定范围内修改重组遗传物质DNA，从而为探索基因在生物体内的具体功能提供可能性。随着生物学的不断发展，特别是PCR技术的发展以及DNA定点突变技术的建立，DNA定向克隆现已成为整个分子生物学领域的基础。DNA定向克隆是指将供体DNA片段克隆至受体DNA上特定位置，比如说多克隆位点。传统的DNA定向克隆通常包含以下步骤： 

1)使用5’端添加特定限制性酶切位点的引物扩增供体DNA片段； 

2)供体DNA片段扩增产物纯化后连接至T载体中； 

3)使用预先设计好的酶切位点将目标片段从T载体中酶切分离出来并进行纯化； 

4)使用同步骤3)同样的酶切位点将受体DNA线性化，并进行纯化； 

5)使用步骤3)和4)中纯化得到的供体DNA与受体DNA按一定比例进行连接反应； 

6)将步骤5)中的连接产物转化至感受态细胞中； 

7)单克隆鉴定、提取正确连接的重组DNA。 

由此可见，传统的DNA定向克隆是一件非常耗时耗力的工作，且克隆效率差，成功率低。此外，由于供体DNA片段中常常包含多种酶切位点，因此能否选择到合适的用于克隆的限制性内切酶成为制约这种技术发展的最大障碍。在生物学飞速发展的今天，伴随着DNA测序技术以及合成生物学的极大发展，低效率的传统克隆方法已无法满足日趋多样化和复杂化的克隆需求，尤其是无法满足高通量克隆需求。 

新型的基于重组原理的克隆方法可以有效消除酶切位点对克隆策略的限制，具有适用性广、通量高等诸多潜在优点。目前已有几种可以满足高通量克隆需求的重组克隆系统相继问世：通用载体质粒融合系统UPS、GateWay入门克隆系统和MAGIC克隆系统。其中，通用载体质粒融合系统UPS、GateWay入门克隆系统是基于体外位点特异性重组原理开发的，而MAGIC克隆系统是基于体内同源重组和细菌杂交原理而开发的。以上三个克隆系统可以完成任意DNA片段在不同背景下的无缝穿梭，且操作流程具有通用性，在一定程度上可以满足多样化、高通量的克隆需求。然而令人遗憾的是，这些非连接依赖性的克隆系统都存在着一些自身无法避免的缺陷。首先，和传统克隆方法相比，除了Gateway克隆系统之外的另外两种方法对最初的基因克隆都没有明显优势。而Gateway克隆需要使用极其昂贵的酶来完成最初的基因克隆，而且引物设计时需要添加特定的一段很长的包含重组位点的序列。其次，这些克隆系统要求最初的基因克隆必须在固定的载体上进行，如果需要将目的基因克隆至指定载体中，这些系统是不能使用的。第三，这些克隆系统只能容许一次克隆一个供体DNA片段，不适用于复杂的多供体片段一次性拼合克隆。 

由于上述种种缺陷，这三种位点特异性重组克隆系统无法得到广泛的应用。同源重组是发生在生物体内的另一种DNA重组形式。相比较位点特异性而言，同源依赖性的重组具有极大的优势。首先，同源性依赖的DNA重组不需要特定的DNA序列，仅仅需要供体DNA和受体DNA在重组位点有一定长度的可以完全匹配的同源序列即可，而位点特异性重组需要特定的DNA序列才能实现。因此，如果用同源重组代替位点特异性重组进行共同体DNA克隆，可以消除其最初的基因克隆只能向指定载体上进行这一限制，使得供体DNA克隆具有更高的灵活性和选择性。其次，基于同源重组的克隆策略，容许对多个供体片段进行一步的拼合克隆，即同时完成多个供体片段的连接拼合并克隆至受体DNA。这一优点为复杂的基因或者载体改造提供了一种一步式的解决方案。