[发明专利]一种非连接依赖性的快速克隆方法

权利要求书

1.一种利用核酸外切酶和单链结合蛋白介导的体外同源重组反应对供体DNA片段进行快速克隆的方法，其特征在于：先通过在扩增引物5’端引入附加序列使得供体DNA两末端与受体DNA两末端分别有至少12bp的同源序列，再将受体DNA线性化，供体DNA与线性化的受体DNA在核酸外切酶和单链结合蛋白的催化下能在体外高效的形成重组中间体，该中间体直接转化感受态细胞就能完成供体DNA至受体DNA的克隆过程。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于是一种快速克隆的方法，其中供体DNA无需内切酶处理就能直接克隆至受体DNA。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的供体DNA在PCR扩增引物5’端需引入附加序列。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，供体DNA的PCR扩增正向引物5’端需添加至少12bp受体DNA5’端同源序列，即其5’端反义链末端最后12bp DNA序列；供体DNA PCR扩增反向引物5’端需添加至少12bp受体DNA3’端同源序列，即其3’端正义链末端最后12bp DNA序列。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的受体DNA需要进行线性化。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述线性化是使用DNA限制性内切酶进行，或是直接使用受体DNA全长PCR扩增产物。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA外切酶是5’DNA外切酶，或是3’DNA外切酶，包括但不仅限于以下几种：大肠杆菌外切酶VII、T7外切酶基因6、大肠杆菌外切酶I、大肠杆菌外切酶III、T4聚合酶。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单链结合蛋白是指能与单链DNA(ssDNA)结合的蛋白，包括但不仅限于以下几种：大肠杆菌SSB、真核生物复制蛋白RPA、RecA、T4基因32蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化体外同源重组反应的酶液中包含至少一种DNA外切酶和至少一种单链结合蛋白。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，供体DNA与受体DNA分别使用核酸外切酶处理后，再混合并加入单链结合蛋白进行重组反应；或将供体DNA与受体DNA混合后同时加入DNA外切酶以及单链结合蛋白进行重组反应。