[发明专利]一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵和生物技术领域。涉及一种低产尿素黄酒酵母工程菌的构建方法，采用“自克隆”技术，不属于转基因范畴，具有工业应用前景。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，以下简称EC)是被国际癌症研究机构(IARC)确认的人类可能致癌物质(2A类)；美国国家毒理计划早已将其列入“有理由预料引起癌症的物质”名单。EC广泛存在于发酵食品(酱油、乳酪、酸牛奶等)与酒精饮料(各种蒸馏酒与酿造酒)中，对消费者是造成极大威胁。目前，世界各国非常重视EC的研究与控制。1985年加拿大政府的卫生与福利组织规定了各类酒中EC的限量标准：佐餐葡萄酒30μg/L，强化葡萄酒100μg/L，蒸馏酒150μg/L，水果白兰地400μg/L，日本清酒100μg/L。1987年美国FDA也规定了EC的限量标准：佐餐葡萄酒15μg/L，强化葡萄酒60μg/L。2002年联合国粮农组织规定葡萄酒中EC含量不得超过20μg/L。黄酒是我国的特产，国外对黄酒的限量标准参照日本清酒，即100μg/L。受多方面因素影响，目前我国仍没有制定有关EC的限量标准，黄酒、葡萄酒等发酵酒中EC含量问题非常突出。

黄酒中的EC主要来源于尿素与乙醇的自发反应而形成，其生成量受尿素的浓度、乙醇含量、反应温度、反应时间和pH值等因素影响。黄酒中的尿素主要是在发酵过程中由酵母菌代谢所产生。酵母菌细胞内精氨酸经精氨酸酶(CAR1)催化，水解生成EC的前体物质——尿素和鸟氨酸。酵母菌在生长繁殖和进行酒精发酵时，合成的大量尿素除了满足自身菌体需要外，多余的尿素被分泌到体外，进入发酵醪液与乙醇自发反应形成EC。

目前，控制与降低黄酒中EC含量的措施有：(1)适当调整工艺参数，比如降低煎酒温度以及缩短煎酒时间等。傅建伟等申请的发明专利(专利号：CN102161956A)通过改变黄酒酿造工艺在一定程度上降低了黄酒中尿素的含量。(2)添加酸性脲酶至压榨后的酒中以去除尿素，进而减少EC的形成量。周建弟等研究了利用酸性脲酶降低黄酒中尿素含量的条件，在一定条件下可以降低黄酒中约80％的尿素。(3)进行酵母菌株改良育种以筛选得到低产甚至不产生尿素的酵母菌株，进而大幅度减少EC的形成量。王德良等申请的发明专利(专利号：CN101550401)采用化学诱变的方法进行了低产尿素黄酒酵母的筛选，产尿素量降低了50％左右。对黄酒而言，前两项措施虽然有一定效果，但都不显著。而且，改变煎酒温度和时间会给黄酒带来生物稳定性风险，并影响成品酒的风味；酸性脲酶依赖从日本进口，价格昂贵，而且会增加染菌风险；采用诱变的方法进行菌株选育，工作量大，筛选结果不可预见，而且诱变后菌株自身的安全性不可控制。应用基因工程手段构建出具有生物安全性的食品级低产或不产尿素黄酒酵母工程菌进行黄酒生产，可以从根本上解决黄酒中的EC问题。

通过自身克隆技术构建酵母工程菌，目的基因来源于出发菌株自身，不引入任何外源DNA片段，因此不属于转基因范畴，这种酵母工程菌更容易被企业和消费者接受，有实际应用前景。“自克隆”技术由于具有生物安全的优点，目前已成为对工业微生物，尤其食品微生物进行遗传改良的首选技术，该技术在选育优良性能啤酒酵母和葡萄酒酵母方面已经取得了明显的成效。2006年1月，美国食品药品管理局(FDAUSA)和加拿大健康署(Health Canada)已批准1株利用“自克隆”手段构建的低产尿素工业葡萄酒酵母(商品名wine yeast ECMo01)应用于工业化葡萄酒生产。使用该工程酵母生产的霞多丽葡萄酒中的EC含量较出发菌株下降了89.1％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是采用“自克隆”技术构建低产尿素的黄酒酵母工程菌，以期为工业上解决黄酒中氨基甲酸乙酯含量偏高问题提供有效的参考方法。酿酒酵母CUP1基因编码铜金属硫蛋白，在酵母细胞中参与过量铜的解毒作用。每个野生型二倍体酵母基因组中含有2个CUP1基因，酵母只能在Cu²⁺小于3mM的培养基中生长；而重组转化子增加了CUP1基因的拷贝数，能在Cu²⁺为3-7mM的培养基中生长。本发明利用CUP1基因，通过“自克隆”技术破坏黄酒酵母精氨酸酶基因(CAR1)，构建低产甚至不产尿素的黄酒酵母，以达到显著降低黄酒中EC形成的目的。

本发明构建低产尿素黄酒酵母工程菌的方法由以下步骤组成：

(1)黄酒酵母CAR1基因及CUP1基因的获取

在Internet公开的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)标准菌株基因组序列数据库