[发明专利]以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于用植物的外植体离体培养的方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。

背景技术

诺丽（Morinda citrifolia）是一种生长于热带、亚热带的茜草科巴戟天属的常绿小乔木或灌木。诺丽是一种天然的水果，营养成分十分丰富，包含了人体所需的几乎所有的营养元素。诺丽在全球范围内的分布地区十分稀少，我国诺丽资源短缺，仅分布于海南及西沙群岛、台湾，近年在云南热带地区引种栽培。诺丽离体再生体系的建立对于后续的基因工程操作非常重要，但国内外的研究大多还停留在引种育苗阶段，国内外鲜见离体再生方面的报道。“诺丽(Morinda citrifolia L.)离体快速繁殖研究”是我们在中国知网CNKI数据库所检索到的文章，按照该文取诺丽种子发芽后，胚的子叶和下胚轴作为实验材料，并根据其介绍的方法，我们反复实验了3次均未诱导出愈伤组织。而对诺丽的愈伤组织诱导及植株再生进行研究，将可为产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定基础。

发明内容

本发明目的是以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度6-BA的MS培养基上进行离体培养，进行诺丽离体快速繁殖，提供一种诺丽的愈伤组织诱导及植株再生的方法。

本发明的目的通过以下方式实现，步骤包括：

（1）愈伤组织的诱导：

将诺丽无菌苗的根切下，剪成0.5cm～1cm的小段作为外植体，轻轻接入培养基中，并使外植体充分与培养基接触，培养基为MS培养基（附加3%蔗糖和6‰琼脂粉）+1.5mg/L 6-BA，接种约15天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中； 

（2）愈伤组织上不定芽的诱导：

20天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约1cm时将其切下，于MS培养基（附加3%蔗糖和6‰琼脂粉）+1.0 mg/L 6-BA或MS培养基（附加3%蔗糖和6‰琼脂粉）+1.5 mg/L 6-BA下培养35天～40天；

（3） 不定芽的再生：

当步骤（2）中长出的不定芽长到1cm～2cm时，将其剪下，接入MS培养基（附加3%蔗糖和6‰琼脂粉）+1.0 mg/L 6-BA 的中培养约30天；

（4） 壮苗生根：

从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约1 cm的其它带芽茎段，接种于MS培养基（附加3%蔗糖和6‰琼脂粉）+0.3 mg/L NAA中诱导生根，培养30～50天，得到完整植株； 

（5） 移栽：

    将诺丽根系已发育良好的培养瓶移至遮光率75%的温室中炼苗7天后，从培养瓶中移出诺丽试管苗，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，适量喷水保持叶片及土壤湿润，在自然光照下正常管理；

以上MS培养基pH值为5.8；培养基均在1.1 kg/cm²的压力、121℃下灭菌20 min；愈伤组织的诱导培养试验均在25±2℃和2000 lx光照强度下进行，每天光照12h。

所述的方法进一步是将步骤（1）培养诱导约28天的愈伤组织颗粒转入MS（附加3%蔗糖和6‰琼脂粉）+1.5mg/L 6-BA培养基上进行愈伤组织的继代培养，再按照以上所述的步骤（2）～（5）进行操作。

本发明具有的效果和意义是：

多数植物在离体培养诱导愈伤组织时，通常需要添加NAA、IAA、2,4-天等多种生长调节剂。由于本发明取诺丽试管苗的根部为外植体，根部自身含有较多的生长激素，为离体培养的外植体提供了植物个体正常发育的生物学基础。因而，本发明在MS培养基只加入6-BA一种生长调节剂，也能对根部愈伤组织产生诱导，得到数量较多、质量较好的愈伤组织。并且，在6-BA的三个浓度梯度中，高浓度的6-BA更利于诱导诺丽根部愈伤组织。特别是当采用6-BA浓度为1.5 mg/L时，对根部愈伤组织达到95.65%的诱导率，且时间较短，只需要15天左右就开始有愈伤组织的发生。

在愈伤组织诱导发芽试验中，愈伤组织在6-BA浓度较高的培养基中培养，发芽率也较高，说明6-BA浓度高有利于芽的分化；这是由于在上一步骤中6-BA浓度较高的培养基诱导出的愈伤组织质量较好，因此，在诱导发芽中有利于芽的分化。另外，愈伤组织在不更换新鲜培养基、置于原培养基中持续培养的情况下，40 天左右，愈伤组织上也能陆续分化出小芽，但发芽率较低。