[发明专利]调节细胞微管动态新机制的发现

说明书

技术领域：

本发明属于基础生命科学，生物化学，细胞生物学，分子生物学，脑科学，神经细胞骨架学和神经细胞信号转导学等多个领域，创新性地揭示了细胞微管解聚的新机理和神经细胞形成及工作的基本原理。 

背景技术：

细胞微管的动态和神经细胞轴突的形成，细胞分裂以及细胞移动等有密切的关系。通常认为，细胞内微管的形成间接地被微管结合蛋白(MAP，tau)的磷酸化影响，但微管动态的基本机理仍然不明。还没有关于既直接磷酸化微管蛋白也以其磷酸化机理影响微管动态的激酶的报道。模式生物秀丽线虫和哺乳动物的神经系统在形态学和生物化学上是相似的；一个保存性基因在秀丽线虫和哺乳动物的不同实验系里能表达相同的功效。秀丽线虫的unc-51基因编码一个从线虫到人类的进化上具有保存性的丝/苏氨酸蛋白激酶，是神经形成所必须的；这个基因的突变引起线虫的神经形成及运动的欠缺和短粗体形。揭示unc-51基因所编码的蛋白激酶的靶蛋白和其生物化学功能的意义是重要的。 

发明内容：

本发明的目的在于揭示unc-51基因所编码的蛋白激酶的重要底物和其生物化学功能，弄清楚神经细胞形成的分子机理，为神经疾病的治疗提供崭新的原理和方法。本发明的内容为： 

(1)首次揭示微管蛋白既能和UNC-51激酶结合，更能作为此激酶的底物被磷酸化 

微管蛋白和UNC-51激酶的结合如图1，图2和图7所示。图1是把表达UNC-51激酶蛋白的人胚肾HEKs293细胞的溶胞产物用于免疫印迹后的结果，这图显示在被转染的HEKs293细胞内，UNC-51激酶蛋白结合着微管蛋白。图2的体外酶联免疫吸附测定结果显示，来自秀丽线虫及牛脑的微管蛋白都能够结合UNC-51激酶蛋白。图7是激光扫描荧光共焦显微镜的图像，这图像显示在非州绿猴肾细胞(COS-7)质基质中，带红色荧光的颗粒状UNC-51激酶蛋白和带绿色萤光的颗粒状微管蛋白结合产生了颗粒状的黄色荧光。 

图3显示UNC-51激酶在体外能够磷酸化来自牛脑的α/β微管蛋白亚基并自我磷酸化，ATP和GTP均可作为磷酸供体。图4显示UNC-51激酶在体内(人胚肾HEK293细胞)磷酸化微管蛋白并自我磷酸化。图5显示UNC-51激酶蛋白本身，秀丽线虫和牛脑由来微管蛋白的丝 氨酸被UNC-51激酶磷酸化。 

(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能解聚微管并能输送粒状微管到细胞质基质中去 

从图6可看出，过量表达UNC-51激酶蛋白(红色，图6左箭头所指)的COS-7细胞的微管已经消失(图6右箭头所指)，这表明UNC-51激酶活性可在细胞里解聚微管。 

和图8中无激酶活性的UNC-51突变蛋白(K39M)在细胞核周围形成的积聚体相比，图7显示，UNC-51激酶活性能输送粒状微管到细胞质基质中去。 

(3)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能够诱导HeLa细胞变成多分枝的神经性细胞 

图9显示，UNC-51激酶活性能诱导人宫颈癌海拉(HeLa)细胞成为分叉神经似的细胞。 

图10表示UNC-51激酶活性通过对细胞内微管的磷酸化解聚反应诱导神经轴突形成的模型。 

附图说明：

图1微管蛋白和UNC-51激酶的体内结合 

图2微管蛋白和UNC-51激酶的体外结合 

图3UNC-51激酶在体外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化并自我磷酸化 

图4UNC-51激酶在体内磷酸化微管蛋白 

图5UNC-51激酶在体外磷酸化自我的和微管蛋白的丝氨酸 

图6UNC-51激酶活性能解聚细胞内微管 

图7UNC-51激酶活性能输送粒状微管到细胞质基质中去 

图8无激酶活性的UNC-51突变蛋白(K39M)和微管蛋白在细胞核周围形成积聚体 

图9UNC-51激酶活性能诱导海拉(HeLa)细胞成为分叉神经似的细胞 

图10UNC-51激酶活性通过对细胞内微管的磷酸化解聚反应诱导神经轴突形成的模型 

具体实施方式：

【1】UNC-51蛋白激酶和微管蛋白结合的测定 

用细胞溶解缓冲液溶解表达UNC-51蛋白激酶的HEK293细胞，得到的溶胞产物的上清用于免疫印迹。利用亲和层析法从以上溶胞产物的上清纯化得到UNC-51蛋白激酶。运用固相酶联免疫测定法(ELISA)分析微管蛋白和UNC-51蛋白激酶的体外结合。 

【2】激酶活性的测定