[发明专利]一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法

说明书

本专利申请由天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室完成，得到国家自然科学基金（30901094），天津市科技计划（09JCYBJC15000），天津市教委基金（20080618）以及国家科技支撑计划（2011BAD13B07,2011BAD13B04）的资助。

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，涉及利用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染。更具体的说：是一种检测β诺达病毒基因的特异性引物及其检测方法。

背景技术

β诺达病毒属于诺达病毒科，其基因组由两条正链RNA构成，可感染40多种养殖鱼类，引发病毒性神经坏死病，又称作空泡性脑视网膜炎，是世界范围内流行的鱼类疾病，受感染的鱼苗死亡率接近100%。提早发现、快速诊断对于该病的防控至关重要。  目前，对于诺达病毒基因复制和蛋白成熟过程，科学家们已经有了较多的了解，但快速诊断技术尚不完备，常用的诊断方法例如：行为体色观察、组织病理检查、RT-PCR法检测病毒衣壳蛋白基因、原位杂交法检测病毒核酸在组织中的分布、免疫学方法等。

链置换型聚合酶可以在合成新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，因此扩增不需变性步骤，可以在等温条件下进行，基于该原理的环介导等温扩增技术（即LAMP技术）已显示出较好的应用前景，近年来广泛应用于微生物检测，它与常规的基因诊断技术相比有明显的优势，该技术尤其在现场操作、检测时间、对设备的要求、结果判断方面有更大的优势。

中国专利(申请号: 200610011855.X) 公开了一种环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测HCV和H5N1等RNA病毒基因的方法，它是对包括RNA病毒在各种生物制品、献血员、病人血液标本等的监测，每种病毒设计出六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成在等温环境中的循环置换扩增反应，最后用电泳或肉眼来检测结果。经检索本发明利用特殊设计的引物，并且采用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于利用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染，以此来提供一个在养殖现场能够快速准确检测β诺达病毒的手段，以便于高效检测样品是否受到β诺达病毒感染；与常规技术相比，本发明不需要分别在不同反应体系中进行核酸反转录和PCR扩增等过程，而是将反转录和扩增以及染色检验等各个过程置于同一个体系内完成，而且反应过程中不需额外补液以及更换反应管等操作，能较好地避免人为因素干扰，此外，本方法只需要简单的水浴锅即可完成实验，既大大缩短了反应的时间，又不需使用昂贵的PCR仪，省钱省力。

本发明主要用于水产生物病害诊断、防治，不但具有高效、快速、准确及操作简便等特点，而且对检测样品的形式具有广泛的适应性，检测样本可以是病灶组织的粗提液，或是由其抽提的RNA，还可以是由抽提的RNA反转录获得的cDNA。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种用于检测β诺达病毒基因的特异性引物，其特征在于包括：2条外侧引物：N2L2fw，CGTCCGCTGTCCATTGAC；N2L2rw，GGGGCTGCTCATCAGAGT；

2条内侧引物：N2L2fn，GCAGGTGTGCCAGCATTTCCTTTTTACAGCCTTGGAACTGGAGA；N2L2rn，CTGGTTTCGCTGGGGCATCTTTTTGTAGGCAACGCCATCTGTG。

本发明所述的特异性引物快速检测β诺达病毒基因的方法，其特征在于按如下步骤：

（1）使用上述的2条外侧引物和2条内侧引物序列，采用逆转录和链置换扩增联用的方案，在反应体系中加入供试模板进行90分钟扩增反应；扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：预混引物5μL，dNTP 4μL，1×Thermopol Roaction Buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶 1μL，M-Mlv反转录酶 1μL，模板5μL，DEPC水 6.5 μL；混匀后按照42℃，10min；65℃，45min；80℃，10min程序进行孵育，4℃保存；其中的预混引物体积比为：N2L2fn：N2L2fw：N2L2rn：N2L2rw=4:1:4:1（浓度为10μM）；