[发明专利]制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种制备人干扰素β1a的细胞培养方法和细胞培养基及细胞培养基的应用。

背景技术

人干扰素β(IFN-β)是具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要细胞因子，主要由成纤维细胞和某些上皮细胞产生，普通的干扰素诱生剂，例如病毒、双链RNA和一些微生物均能够诱导IFN-β的产生。自然IFN-β是一种糖蛋白(糖分约占20％)，相对分子质量约20000，由166个氨基酸组成，有21个氨基酸组成的信号肽，在S-M之间切开。在分子的第17位、31位、141位为Cys，在31位和141位之间形成的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的。hIFN-β基因长777bp，位于染色体9p22，与IFN-α基因簇邻近。人白细胞干扰素与成纤维细胞干扰素之间在核苷酸水平上有45％的同源性，在氨基酸水平上有29％的同源性。IFN-α与IFN-β基因均无内含子。IFN-α与IFN-β结合于同一受体，但后者与受体的亲和力大于前者。

美国FDA已于1993批准IFN-β1b(大肠杆菌表达)和1996年批准IFN-β1a(CHO细胞表达)用于治疗多发性硬化症(MS)。目前，IFN-β是能够控制MS反复发作的唯一药物。据估计，我国MS患者至少有数十万人，迄今尚无特效药。CHO细胞与大肠杆菌表达的IFN-β1a相比，具有较高的抗病毒比活性，较小的副作用以及较长的半衰期。

中国仓鼠卵巢细胞-CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)目前被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品。适合用于CHO细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F12等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清<常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15％)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等。但即使采用低血清培养，还是不能忽视血清带来的问题(如在培养过程中贴壁，不适用于大规模培养)。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发无血清培养基。

目前国内干扰素β1a研究较少，产干扰素IFN-β1a(CHO细胞表达)的培养基配方效率较低，亟需开发一种适合工业化生产，成本低，产量高的产重组人干扰素β1a的细胞培养基和培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种产人干扰素β1a的细胞的培养方法和细胞培养基及培养基的应用，从而得到一种适合工业化生产，活性高，产量高的产干扰素β1a细胞培养方法。

本发明的技术方案为提供一种制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L、所述基础培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CHO培养基，所述添加物为D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。

优选的上述培养基中，所述添加物还包括正丁酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或几种。

优选的上述培养基中，所述基础培养基为SFM培养基，所述SFM培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CHO培养基。

优选的上述培养基中，包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸钠：0.05-1mM、磷酸二氢钾：0.5-3.5mM、氯化钠：10-60mM。

优选的上述培养基中，包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸钠：0.5mM、磷酸二氢钾：0.5mM、氯化钠：20mM。

本发明的另一个方案为提供一种制备人干扰素β1a的细胞培养方法，包括以下步骤