[发明专利]制备人干扰素β1a的细胞的培养方法和培养基及其应用

权利要求书

1.制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，其组分包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的浓度为12-18g/L，所述添加物为D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L。

2.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，所述添加物还包括正丁酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或几种。

3.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，所述基础培养基为SFM培养基，所述SFM培养基为CHO-S-SFM II培养基或SFM4CHO培养基。

4.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，包括以下浓度的各组分：基础培养基：12-18g/L、D-半乳糖：0.05-0.45g/L、D-甘露糖：0.3-0.7g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.10-0.50g/L、D-葡萄糖：1.0-5.0g/L、正丁酸钠：0.05-1mM、磷酸二氢钾：0.5-3.5mM、氯化钠：10-60mM。

5.按权利要求1所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养基，其特征在于，包括以下浓度的各组分：基础培养基：15g/L、D-半乳糖：0.05g/L、D-甘露糖：0.3g/L、N-乙酰氨基葡萄糖：0.3g/L、D-葡萄糖：5g/L、正丁酸钠：0.5mM、磷酸二氢钾：0.5mM、氯化钠：20mM。

6.制备人干扰素β1a的细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的细胞冻存管复苏，传代培养，转瓶培养；

b、按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行细胞罐培养，每天转速增加10rpm，最终加至120rpm，采用含血清培养基培养5-10天，在灌流速度大于0.2-0.8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换权利要求1至4所述的制备人干扰素β1a的细胞培养基，调整培养温度为34-36℃，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3-2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右；

c、灌流培养至灌流速度小于0.05-0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0-3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

7.按权利要求6所述的制备人干扰素β1a的细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取携带有表达人干扰素β1a表达基因质粒的中国仓鼠卵巢细胞冻存管复苏，通过25cm²、75cm²、175cm²方瓶传代培养15天，传代5-7代，3L转瓶培养7-12天，获得种子细胞量5.0×10⁷-1×10⁹cells；

b、5L细胞罐培养：按0.2×10⁶-2×10⁶cells/ml接种量接入步骤a转瓶消化下来的细胞，设置起始条件37℃、pH6.8-7.8、溶氧大于20％、转速40rpm进行培养，以后每天转速增加10rpm，最终加至120rpm。采用含含血清培养基培养5-10天，所述含血清培养基为含10％的新生牛血清，90％高糖DMEM培养基，灌流速度大于0.2-0.8L/h时，瞬间排空含血清培养基更换权利要求1至4所述的制备人干扰素β1a的细胞培养基，调整培养温度为34-36℃，根据检测的葡萄糖浓度调整无血清培养基灌流速度，控制糖浓度在0.3-2.0g/L之间，无血清培养基灌流培养时间约在30-50天左右；

c、灌流培养至灌流速度小于0.05-0.2L/h，连续检测3次葡萄糖浓度变化不大，均维持在2.0-3.0g/L之间某个数值恒定，检测细胞收集液生物学活性小于0.5×10⁵IU/ml-0.5×10⁶IU/ml时，判断为细胞培养终点，结束培养。

8.权利要求1-4制备人干扰素β1a的细胞的培养基的用途，在含表达人干扰素β1a表达基因质粒的细胞培养中的应用。