[发明专利]利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产单细胞油的方法，尤其涉及一种利用玉米芯木糖渣水解液(糖化液)培养隐球酵母(Cryptococcus curvatus)发酵生产单细胞油的方法。

背景技术

单细胞油脂，又称微生物油脂，是微生物或藻类以碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂，其中有些油脂具有高附加值。其脂肪酸组成与植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸为主，如棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)等。微生物油脂可以广泛应用于食品、医药、精细化工等行业。

目前，国内外工业用油和食用油脂主要来源于动、植物和化石资源，随着可耕用土地的日益减少和化石资源的逐渐枯竭以及生物技术的进步，工业用油势必走向多种渠道开发的途径。单细胞油脂作为一种新型油脂已经引起人们的广泛关注。近年来，关于利用蔗糖、糖蜜、乳糖、工业废液及木质纤维素来生产微生物油脂已经有所报道。刘宏娟等利用两步水解木质纤维素所得水解液和两次补料发酵得到单细胞油，赵宗保等也利用玉米秸秆的无机酸或纤维素酶水解液进行单细胞油的生产。但上述实验所需水解液的获得需要大量的稀酸等化学试剂，带来环境问题的同时极大地增加了生产成本。

玉米芯经酸水解，利用其中的半纤维素制取木糖醇及低聚木糖等高附加值产品后，废弃的纤维素残渣即是木糖渣，脱木素木糖渣为木糖渣经碱处理脱除木素后的残渣，均为生物炼制过程中产生的废渣。经检索，利用木糖渣和脱木素木糖渣水解液培养产油微生物，生产单细胞油的研究还未有报道，因而利用木糖渣及脱木素木糖渣发酵生产单细胞油的方法具有极其重要的实际意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用玉米芯木糖渣水解液(糖化液)培养隐球酵母(Cryptococcus curvatus)发酵生产单细胞油的方法。

本发明所述利用生物质资源水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法的步骤是：

(1)糖化液制备：取玉米芯木糖渣，以15～35个滤纸酶活单位(FPA)每克干木质纤维素的量添加纤维素酶液，在35～55℃下糖化60～80h；收集糖化液于75～85℃下水浴30～60min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于7000～10000rpm下离心6～10min，得澄清的糖化液；

其中：上述玉米芯木糖渣是指脱木素木糖渣或木糖渣；

(2)糖化液的脱毒处理：将上述糖化液水浴加热至80℃，再加入其质量百分比为0.6～1.2％的活性炭，搅拌30～50min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；

(3)利用糖化液发酵隐球酵母：以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以体积百分比为4～10％的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30±2℃、200±50rpm，摇床震荡培养60～80h，得含单细胞油的发酵液；

(4)单细胞油粗提：将步骤(3)的发酵液于7000～9000rpm下离心8～15min收集菌体，蒸馏水清洗菌体3～4次；以酸热-有机试剂法提取单细胞油，即：以3g湿菌体∶10ml的比例加入4M HCl，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min；然后按3g湿菌体∶5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体∶15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体∶15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油。

上述步骤(1)所述的纤维素酶酶液是商品纤维素酶或是任何能产生纤维素酶的菌种所产生的纤维素酶。商品纤维素酶可以是液体酶，也可以是固体酶粉。纤维素酶的制备方法是：纤维素酶产生菌(例如：青霉属、木霉属或曲霉属菌株)按常规量接种于纤维素酶产酶培养基中，在28～30℃，摇床转速200～300rpm下，产酶发酵96～120小时，然后将所有发酵物在5000～10000r/min的转速下离心15～40min，收集上清液即获得纤维素酶粗酶液。

上述步骤(1)所述纤维素酶添加量优选20～30个滤纸酶活单位每克干木质纤维素，糖化温度优选40～50℃，糖化时间优选70～80h。

上述步骤(2)所述活性炭的质量百分比优选为0.8～1.0％，搅拌时间优选30～35min。

上述步骤(3)所述隐球酵母的培养条件优选是：30℃、200rpm摇床震荡培养65～75h。

上述步骤(4)所述发酵液优选于8000rpm下离心10min收集菌体。