[发明专利]一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性打靶载体和重组细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性表达载体和重组细胞。

背景技术

牛结核病是由M.bovis引起的一种人畜共患传染病，在发展中国家是牛疾病中最具灾难性的疾病之一(Berrada and Barjas-Rojas，1995)。牛型结核分枝杆菌主要侵害牛，牛结核病是由牛分枝杆菌所引起的一种人畜共患的的慢性传染病，其病变特征为病牛逐渐消瘦，在组织器官中形成结节性肉芽肿和干酪样坏死。牛结核病因其易传染，危害严重，因此世界动物卫生组织将其列为B类传染病，我国将其列为二类动物传染。其传播流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。所以，控制牛结核病是一个关系到控制人类结核病能否成功的重要因素。但是目前对结核病的治疗只能采用抗生素治疗，如：链霉素、卡那霉素等。长期使用抗生素会使细菌产生抗药性，所以寻求一种新的治疗结核病的方法迫在眉睫。

随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善，为动物抗病育种提供了新的思路。体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J，et al.An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitryp sin gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，该技术的优点是基因转移在体细胞培养阶段进行，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(Wheeler MB，WaktersE M.Transgenic technology and applications in swine[J].Therioge nology，2001，56：1345-69.)。2006年，美国科学家Maga等培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山羊(Maga EA et al.Consumption of milk from transgenic goat expression human lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinal microfluro[J].Transgenic Res，2006，15：515-519)。2009年，西北农林科技大学生物工程研究所培育出在乳腺中特异表达人防御素的转基因奶牛。现在对于体细胞转基因和克隆技术掌握的比较成熟。

2005年pan等发现结核病的发生是与胞内病原体抗性基因1(Ipr1)有关，该研究证明对结核杆菌易感的动物是由于机体没有Ipr1表达，且该基因仅在巨噬细胞中表达(Pan H，et al.Ipr1gene mediates innate immunity to Tuberculosis[J].Nature，2005，434(7034)：767-772)。这为研究防治结核病提供了新的可能：利用体细胞转基因和体细胞克隆相结合的方式，使得缺少Ipr1表达的牛通过生物技术手段实现Ipr1表达，以达到抗结核病的目的。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于Ipr1基因构建的巨噬细胞异性表达载体和重组细胞，并以构建的包含Ipr1巨噬细胞特异性打靶载体的新生牛耳成纤维细胞系作为核供体细胞的，为预防及控制牛结核病的传播和流行奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种重组Ipr1基因，在Ipr1基因的上游连接牛巨噬细胞特异性启动子MSR1，构成重组基因MSR1-Ipr1。

所述的重组Ipr1基因中，Ipr1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，MSR1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的重组Ipr1基因，在MSR1的上游连接如SEQ.ID.NO.3所示的同源臂LA，在Ipr1的下游连接如SEQ.ID.NO.4所示的同源臂SA，构成重组基因LA-MSR1-Ipr1-SA。

在LA与MSR1之间还设有两个Loxp序列，两个Loxp序列之间设有抗生素正筛选基因。

在通用型打靶载体上克隆重组基因MSR1-Ipr1，并克隆包含牛28号染色体SP-A与MAT1A基因之间间隔序列的同源臂。