[发明专利]一种玻璃酸钠中蛋白质的检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种蛋白质的检测方法，尤指是玻璃酸钠中蛋白质的检测方法。

背景技术：

玻璃酸(Hyaluronic acid，简称HA)，是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₁)n，依据组织来源不同，分子量变化范围为2×10⁵～7×10⁶，双糖单位数为300～11000对。

商品玻璃酸一般为钠盐形式，为白纤维状或粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。玻璃酸钠的大分子网状结构通过与H₂O形成氢键结合大量的水，在体内具有构成多种基质、调节渗透压、调控大分子物质的转运、在细胞周围形成物理屏障以及调节细胞功能等作用。玻璃酸钠可作为眼科手术辅助用药及变形性膝关节病和肩关节周围炎的辅助治疗，还在组织生成、创伤愈合、肿瘤入侵和调节细胞功能诸方面具有重要的生理功能。

玻璃酸钠制剂中残留的蛋白质杂质是导致其致炎症性的主要原因之一。长期以来，中国、日本、欧美等国，都在寻求更好的检测方法，为更准确测出蛋白质杂质含量而努力，为工艺改进提供更准确的数据支持。

在目前的公开的文献中，无论是劳伦法，还是丘比方法检测蛋白质，都存在一些不足。劳伦法所存在的问题如下：1.样品溶解时间长；检测过程中不易混匀；2.样品溶解后溶液粘度大，检测过程中不易混匀，误差大。丘比法所存在的问题如下：1.所用检测试剂多，成本大；2.实验过程时间长，检验效率不高。

发明内容：

本发明的目的是提供一种玻璃酸钠中蛋白质的检测方法，以克服上述检测方法中的不足之处，该方法检测准确，检验成本、检验效率高、检验工作开展方便。

为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：

一种玻璃酸钠中蛋白质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)标准曲线的制备：称取牛血清白蛋白对照品，加氢氧化钠试剂溶解定容，配制成200μg/ml的牛血清白蛋白储备液；将牛血清白蛋白储备液稀释，配制成2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的标准液；移取一定体积各标准液，置于试管中，两个空白管中移取标准液等体积的氢氧化钠试剂，于上述各管中加入标准液等体积的试剂E，立即在旋涡振荡器混合，室温放置5-15min，加入标准液3倍体积的试剂F，立即在旋涡振荡器混合后，在40-60℃水浴放置5-15min，以空白管为对照，测750nm下的吸光度，得出直线回归方程；

(2)样品溶液制备：称取玻璃酸钠中间体样品用标准液等体积的氢氧化钠试剂溶解后，加入标准液等体积的试剂E，立即在旋涡振荡器混合，室温放置5-15min，加入标准液3倍体积的试剂F，立即在旋涡振荡器混合后，在40-60℃水浴放置5-15min，以空白管为对照，测750nm下的吸光度；

(3)由直线回归方程，按下式计算玻璃酸钠中间样品中蛋白质含量，

CW×1000000×100%]]>

式中，C表示样品试管溶液中蛋白质浓度，

W表示样品试管中玻璃酸钠中间样品质量，

所述氢氧化钠试剂的浓度为4.3mg/ml，

所述试剂E是将9.0mg/ml硫酸铜溶液，15.0mg/ml酒石酸钾纳溶液和含碳酸钠为100mg/ml、氢氧化钠为20mg/ml的溶液的体积比为1∶1∶3混合物，

所述试剂F是10倍稀释的福林酚。

在发明的一优选实施例中，步骤(2)中1ml的氢氧化钠试剂中，加入玻璃酸钠中间体样品量为10mg。

本发明的玻璃酸钠中蛋白质杂质的检测方法的检测原理根据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与铜离子螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。