[发明专利]己烯雌酚单链抗体筛选方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种己烯雌酚单链抗体的筛选方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别己烯雌酚的高效抗体与研制可以快速检测己烯雌酚残留的免疫速测试剂盒及治疗相关疾病的用途中。

背景技术

己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是第一个口服有活性的人工合成非甾体雌激素物质。目前在临床上主要用于治疗雌激素低下症及激素平衡失调引起的各种疾病以及用于治疗卵巢功能不全或垂体功能异常引起的各种疾病。在兽医临床上，DES主要用于治疗母猪乏情不孕、诱导母兔发情、治疗产蛋鸡停产、山羊育肥等。另外己烯雌酚在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显。但是，DES能够在动物源性食品如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留，会在水源和土壤中富积，造成环境激素污染恶性循环，并通过食物链引发动物和人的癌变，引起少儿的发育早熟以及男性女性化等危害。现在国际癌症研究机构已经确认DES是经胎盘致癌的，并且把它列为人类致癌物质。针对上述情况，发展检测己烯雌酚残留的简便、快速、灵敏的方法是有效遏制滥用己烯雌酚的重要技术手段和维护法规制度的必要保障。免疫学分析方法检测DES具有快速简便的特点，而免疫分析方法检测需要有DES的特异性抗体。但是DES是小分子半抗原，免疫原性不强，通过传统的免疫动物的方法制备抗体较困难，制备的周期也较长。

基因工程抗体单链抗体(Singe chain variable fragment，ScFv)具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点。目前，主要应用核糖体展示技术和噬菌体展示技术来筛选和制备单链抗体。核糖体展示技术是一种完全不依赖于细胞的体外展示技术，文库库容量远远大于噬菌体单链抗体文库，此外核糖体展示技术还具有建库和筛选方法简便，便于引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体B细胞。从理论上讲，能够代表所有初级B细胞含有的抗体基因的多样性，使用任何抗原都可能从中筛选到相应的抗体，具有较强的通用性。利用核糖体展示技术筛选针对小分子半抗原抗体的研究较少，尤其是从天然抗体文库中筛选更为少见。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种潜在的检测和医学用抗己烯雌酚单链抗体。

本发明的第二个目的提供一种抗己烯雌酚单链抗体的制备方法。

本发明的第三个目的提供抗己烯雌酚单链抗体在制备检测试剂盒中的用途。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供的抗己烯雌酚单链抗体是从核糖体展示鼠源天然单链抗体库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。

本发明提供的抗己烯雌酚单链抗体的制备方法为：

1.核糖体展示鼠源天然单链抗体库的构建

从未经免疫的6-8周龄Balb/c、C57/BL6小鼠的脾细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链后，扩增VH、VL基因片段，大小分别为380bp，350bp左右；合成(G4S)3linker，经序列测定，与理论序列完全一致。利用SOE-PCR构建单链抗体文库，大小为750bp，经序列比对，单链抗体的文库中有约80％的单链抗体都可以正确翻译，无移码突变和致死突变，无终止密码子；测序正确的单链抗体的互补决定区都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。

扩增出大小为102bp核糖体展示元件T(包括T7启动子，5’茎环，核糖体结合位点)和大小为298bp间隔序列P(噬菌体P蛋白部分序列)，含3’茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法(splicing by overlap extension，SOE)将T片段与scfv文库连接，再将P片段与其拼接，构建成核糖体展示单链抗体文库，大小为1200bp左右。

其中小鼠可以是其他品系小鼠，优选几种品系小鼠的组合

其中连接VH、VL的链接linker为几个G4S的组合，优选(G4S)₃

其中核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，本发明优选原核启动子特别是T7启动子

2.抗己烯雌酚单链抗体的筛选