[发明专利]己烯雌酚单链抗体筛选方法及其用途

权利要求书

1.一种抗己烯雌酚单链抗体，其特征在于可以特异识别小分子物质己烯雌酚

2.权利要求1抗己烯雌酚单链抗体制备方法，由如下步骤组成：

(1)核糖体展示鼠源天然单链抗体库的构建

从未经免疫的6-8周龄Balb/c、C57/BL6小鼠的脾细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA第一链后，扩增VH、VL基因片段，大小分别为380bp，350bp左右；合成(G4S)3linker，经序列测定，与理论序列完全一致。利用SOE-PCR构建单链抗体文库，大小为750bp，经序列比对，单链抗体的文库中有约80％的单链抗体都可以正确翻译，无移码突变和致死突变，无终止密码子；测序正确的单链抗体的互补决定区都为不同的CDR，其中氨基酸序列变化多样，说明构建的单链抗体文库多样性好，适合于进一步进行单链抗体的筛选。

扩增出大小为102bp核糖体展示元件T(包括T7启动子，5’茎环，核糖体结合位点)和大小为298bp间隔序列P(噬菌体P蛋白部分序列)，含3’茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法(splicing by overlap extension，SOE)将T片段与scfv文库连接，再将P片段与其拼接，构建成核糖体展示单链抗体文库，大小为1200bp左右。

(2)抗己烯雌酚单链抗体的筛选

将构建的核糖体展示单链抗体文库进行体外转录翻译后，用己烯雌酚-BSA和己烯雌酚-磁珠作为抗原固相和液相交替筛选特异于己烯雌酚的单链抗体，通过改变Mg²⁺浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选儿轮的单链抗体DNA文库。经过七轮核糖体展示筛选后，RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。

可以采用己烯雌酚-BSA进行固相筛选，还可以采用己烯雌酚-磁珠进行固相筛选，优选交叉筛选。

Mg²⁺浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。

(3)抗己烯雌酚单链抗体的可溶性功能表达

将单链抗体基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在30KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中。

抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。

标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。

(4)抗己烯雌酚单链抗体的纯化与鉴定

将26株克隆子的表达上清液用间接ELISA和间接竞争ELISA分别鉴定，结果筛选出5株克隆子对DES有特异性的结合；用SPR分析筛出的一株30-3的单链抗体的亲和力为3.79×10^-6M。利用Anti-His tag亲和层析柱对表达的单链抗体进行了纯化。

3.权利要求2中所述小鼠可以是其他品系小鼠，优选几种品系小鼠的组合。

4.权利要求2中所述连接VH、VL的链接linker为几个G4S的组合，优选(G4S)₃。

5.权利要求2中所述核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，优选原核启动子特别是T7启动子。

6.权利要求2中所述筛选方法可以采用己烯雌酚-BSA进行固相筛选，还可以采用己烯雌酚-磁珠进行固相筛选，优选在不同筛选轮次中采用不同方法交叉筛选。

7.权利要求2中所述抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，并根据载体不同选择不同表达宿主，优选pTIG-TRX载体。

8.权利要求2中所述标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6×组氨酸标签等，优选6×组氨酸标签。