[发明专利]通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法

说明书

技术领域

本发明属于基因多态性位点检测领域，特别涉及一种通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法。

背景技术

随着人类药物基因组学的发展，越来越多的研究成果将要运用于临床诊断中，这就要求有大规模的基因多态性位点检测方法。这些年来，将连接反应用于检测基因多态性位点越来越引起人们的重视，国外学者已经做了大量的研究(France Barany et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，88：189-93(1991)，The Ligase Chain Reaction(LCR)in a PCR World，PCR Methods and Applications，1：5-16(1991))。连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)是指在反应中设计两对探针，使得连接反应可以指数扩增模板。连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。

近几年，出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术，测序技术关联用于基因多态性位点检测(Norman P.Gerry1 et al.，J.Mol.Biol.(1999)292，251-262，U.S.Pat.Pub.No.2003/0032016A1)，这些技术的出现大大方便了基因位点的检测，但同时在这些技术中，存在着大量的需要荧光标记的探针，而这些标记的探针往往成本昂贵，为开发和应用造成不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法，以填补现有技术中通用标记探针完成探针标记的空白，克服检测过程复杂的缺陷。

本发明的第一方面提供一组用于基因多态性测序的核酸序列包括：

a)至少一条LDR标记探针，包括三部分，第一部分位于5’端且和待测模板严谨配对，第二部分位于3’端且和通用模板5’序列严谨配对，第三部分位于上述两部分序列中间，是一段用于调整探针长度的、和待测模板或通用模板或其他探针序列均无同源性的随机序列，该探针的5’磷酸化；

b)2到4条LDR检测探针，每条包括两部分，一部分位于3’端且和待测模板严谨配对，另一部分位于5’端是一段用于调整探针长度的、和待测模板或通用模板或其他探针序列均无同源性的随机序列，且该2到4条检测探针通过设计长度不同的随机序列使检测位点上不同的2到4种碱基对应不同的LDR产物长度；

c)至少一条通用荧光标记探针，该探针的5’端磷酸化，3’端用荧光标记并且和通用模板

d)的5’端序列严谨配对；

d)至少一条通用模板，其5’端序列和所述通用荧光标记探针c)严谨配对，其3’端序列和所述LDR标记探针a)严谨配对。

上述的一组用于基因多态性测序的核酸序列的一种优选方式为，所述的待测模板为待测序的多态性序列经PCR扩增后的产物。

上述的一组用于基因多态性测序的核酸序列另一种优选方式为，其特征在于，所述的LDR标记探针a)和LDR检测探针b)与待测模板严谨配对部分的长度范围均为10-25个核苷酸。

上述的一组用于基因多态性测序的核酸序列又一种优选方式为，所述的核酸序列a)-d)中的只是一种为DNA。优选地，所述的核酸序列a)-d)均为DNA。

本发明的第二方面提供一种基因多态性测序方法，包括如下步骤：

(1)提供权利要求1所述的一组核酸序列；

(2)LDR反应，获得荧光标记的2到4条长度不同的LDR产物，对应检测位点上2到4种不同的碱基；

(3)通过荧光标记检测长度不同的LDR产物。

上述的基因多态性测序方法的一种优选方式为，在所述的LDR反应之前有一个PCR反应以扩增待测序的多态性序列，且PCR引物与所述的核酸序列a)-d)均无同源性。

本发明的第三方面提供一种基因多态性测序试剂盒，包括含权利要求1所述的一组核酸序的LDR反应试剂。优选地，所述的试剂盒还包括PCR反应试剂，更加优选所述的试剂盒还包括核酸提取试剂。

本发明的通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法的关键在于探针设计，其具体实施方式之一为：

①针对检测的位点，设计一系列LDR产物的分子量系列；

②设计一个具有特异性的通用荧光标记探针；

③设计一个具有和上述荧光标记探针相同特异性的通用模板；