[发明专利]一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞。

背景技术

奶牛乳房炎(mastitis)又名奶牛乳腺炎，主要由环境中的病原微生物感染引起的，是给奶牛养殖者带来严重经济损失的主要疾病之一，严重影响奶牛养殖业的健康发展。有资料报道美国每年因为奶牛乳房炎造成的奶产品产量和质量下降等损失达到350万美元。奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和亚临床型乳房炎。引起奶牛乳房炎可能有多种因素，包括牛本身的状况、治病的微生物和影响奶牛和微生物环境因素。其中治病的微生物种类很多，金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的病原菌，该菌可引起急性、慢性和亚临床性(隐性乳房炎)乳房炎，给奶业生产带来巨大损失，不仅产量下降，还增加治疗和给奶牛医疗服务的费用(Gill，J.et al，2006.Efficacy and pharmacokinetics of bacteriophage therapy in treatment of subclinical  Staphylococcus aure-us mastitis in lactating dairy cattle.Antimicrob.Agents Chemother.50，2912-2918)。

多年来，治疗奶牛乳房炎都是采用广谱抗生素治疗的方法，尽管有效，但是治愈率不足50％。广谱抗生素的应用也导致了严重的耐药菌株的产生，增加了治疗的难度(D.Ferber.Antibiotic resistance-Livestock feed ban preserves drugs′power.[J].Science 2002；295：27-28)。因此，使用病原菌特异的抗生素有望减少抗性产生的机率。

为了减少广谱抗生素的使用，避免对抗生素有抗性的菌株的出现，我们通过转基因奶牛的乳腺分泌病原菌特异的抗菌素，从而避免大量使用抗生素所引起的问题，抵抗奶牛乳房炎(D.E.Kerr and O.Wellnitz Mammary expression of new genes to combat mastitis[J]Anim Sci 2003.81：38-47)。

转基因动物的生产从20世纪70年代中叶开始，用原核显微注射生产转基因动物持续了20多年(BOWEN RA，REED ML，SCHNIEKE A，et al.Transgenic cattle resulting from biopsied embryos：expression of c-ski in a transgenic calf[J].Biol Reprod，1994，50：664-8)，但这种技术的广泛应用有一定的局限性，外源基因往往是随机整合。在家畜上，胚胎干细胞还没有建系(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A，CHEN LR，et al.Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells[J].Biol Reprod，1997，57：1089)。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J，BHUIYAN M.M.U.，HYUN Y J，et al.An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitrypsin gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，其突出的优点是直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，这样只需在体细胞核移植前选择状态最佳的供体细胞，不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本。