[发明专利]一种长期培养无菌松苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及无菌松苗的培养方法，具体涉及一种长期培养无菌松苗的方法。

背景技术

松材线虫病，又称为松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性病害。国内外许多学者对该病的病因及其致病机理进行了研究，但至今尚无定论。

关于松材线虫病的病原，目前主要存在两种观点。一种观点认为松材线虫是惟一病原。Mamiya (1972)用松材线虫在林分中接种黑松和赤松，造成这两种松树死亡。Kuroda等(1992)研究了松树线虫侵入黑松后的扩散和其他微生物相的变化，发现接种一周后松树体内水分输导受阻碍，但其微生物相和健康松树的一样，直至接种5周后，蓝变菌Cerattocystis spp.和细菌才开始增多。因此，认为接种松材线虫能单独引起松树萎蔫，与其他微生物无关。上述研究结果表明松材线虫可单独引起松树萎蔫，为松树萎蔫病的病原。另一种观点认为松树萎蔫是由松材线虫和细菌共同引起的。Kawazu和Kaneko（1997）在无菌条件下用无菌松材线虫接种30天苗龄的无菌赤松苗，松苗不死亡；而带细菌的松材线虫在同样条件下，却导致无菌松苗萎蔫枯死，因此认为细菌才是松材线虫病的真正病原。洪英娣等（2003）和Han等（2003）用无菌松材线虫或拟松材线虫接种2个月生无菌黑松苗，未能使其褐变和枯萎；而用无菌松材线虫和拟松材线虫与分离自松材线虫体表的细菌分别混合接种却使黑松无菌苗发生枯萎，因此认为松苗萎蔫与所接种线虫的种类无关，而是由其伴生细菌的种类所决定。Zhao et al.（2003）在无菌条件下用松材线虫体表细菌和无菌松材线虫单独接种4个月生无菌黑松苗，不能使松苗发病，但二者的混合物却可使无菌苗萎蔫，提出松萎蔫病是松材线虫与细菌共同侵染引起的复合侵染病害的假说。

从上述研究可以看出，认为松材线虫是惟一病原的试验寄主是自然条件下或温室中的盆栽松苗或大树，而另一种观点所用试验材料是1~4个月生、尚未完全木质化的无菌幼嫩松苗。许多学者认为，几个月生的幼嫩松苗与自然界感病松树在结构上差异较大，不一定能代表松树对松材线虫的反应。为了了解无菌松材线虫的致病性，Tamura（1983）曾用无菌松材线虫于自然条件下接种3年生赤松，结果使其萎蔫枯死，枯萎率达90%。对此结果，Kawazu et al.（1998）认为，由于致病细菌在自然界中普遍存在，当无菌松材线虫重新感染上这些细菌时，从而又获得致病性。

综上所述，在错综复杂的自然条件下对松苗或成年松树进行接种，或在无菌条件下以生理和结构上与成年松树有很大差别的无菌幼苗进行试验，均较难对松材线虫或其伴生细菌的作用进行准确评价。为了准确研究松材线虫及其伴生细菌与宿主松树间的相互关系，要求研究者构建一个新的测定体系，即在严格控制的无菌条件下，培育完全木质化的无菌苗木进行接种试验。然而，关于无菌松苗的培养，通常是将无菌萌发的幼苗接种于琼脂固体培养基中进行培养。若想更换新鲜培养基，需将松苗从原有培养基中拔起，由于松苗的根系伸展于琼脂固体培养基中，较难拔起，即使将其拔起，也很难再将幼苗移植于新鲜培养基中进行培养。所以，该方法通常只能培养几十天到3、4个月，时间再长，幼苗常出现顶枯梢死的现象。这可能是由于培养基失水或由于松苗根系分泌物在培养基中堆积造成微环境不适所致。至今尚无长期培养无菌松苗的技术。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种长期培养无菌松苗的方法，以实现为松材线虫病相关研究提供一种简易可行的制备多年生无菌松苗的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案为：

一种长期培养无菌松苗的方法，包括以下步骤：

（1）制备PDA平板备用；

（2）制备无菌松树成熟种子，移入PDA琼脂平板，25℃，培养至萌发，获得无菌幼苗；

（3）制备DCR液体培养基，pH5.8，分装于培养容器；

（4）在底部带小孔容器底部垫上脱脂棉，上部填入珍珠岩，将该容器置于盛有DCR液体培养基的培养容器中，121℃高压灭菌，备用；

（5）将无菌幼苗移植于珍珠岩中，于温度24~26℃、光照2000 Lux、每日光照14~18h条件下培养，定期更换DCR新鲜培养液，直至获得所需年龄的无菌松苗。

步骤（2）中，制备无菌松树成熟种子的方法为：取松树成熟种子，用洗洁精将其表面洗净，0.1%高锰酸钾浸泡12h，流水冲洗1h，在无菌条件下剥除种壳，用无菌纱布包裹去壳种子，置于70%乙醇表面消毒30~35s后再用0.1%升汞处理3~4min，用无菌水冲洗3~5次。