[发明专利]黑鲷抗菌肽表达载体与构建方法及表达产物与制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，尤其是涉及黑鲷抗菌肽(Hepcidin)表达载体与构建方法及表达产物与制备方法。

背景技术

抗菌肽是海洋动物先天免疫系统的重要组成成分。研究、开发与应用抗菌肽，将有效解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性问题，并将改善由于养殖饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留和水环境污染等问题，具有重要的科学意义和实际应用价值。

Hepcidin是一类C端保守位点富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽。本申请人(1.Ming Yang，Ke-Jian Wang，Jun-Hui Chen，Hai-Dong Qu，Shao-Jing Li.Genomic organization and tissue-specific expression analysis of hepcidin-like genes from black porgy[J]Fish Shellfish Immun，2007，23：1060-1071)于2007年报道从我国养殖黑鲷中克隆获得了7个hepcidin-like基因(AS-hepc 1～7)，在细菌人工感染下黑鲷抗菌肽hepcidin mRNA的表达量明显上升，说明了该抗菌肽在黑鲷体内具有重要的免疫作用。并且在蛋白水平上证实了人工合成的AS-hepc2和AS-hepc6成熟肽对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均具有杀伤作用(2.Ming Yang，Bei Chen，Jing-Jing Cai，Hui Peng，Ling-Cai，Jian-Jun Yuan，Ke-Jian Wang.Molecular characterization of hepcidin AS-hepc2 and AS-hepc6 in black porgy(Acanthopagrus schlegelii)：Expression pattern responded to bacterial challenge and in vitro antimicrobial activity[J]Comp Biochem Physiol BBiochem Mol Biol.，2011，158(2)：155-163)。

黑鲷AS-hepc2是肝脏特异性表达的hepcidin变体，其基因(GenBank accession numbers：AY669377)由267个碱基组成，编码88个氨基酸^[1]。同其他已经发现的hepcidin抗菌肽结构一样，AS-hepc2由N端的信号肽(前24个氨基酸)，前导肽(40个氨基酸)和位于C端的成熟肽(24个氨基酸)组成。AS-hepc2前体肽曾经由大肠杆菌原核表达体系Top10F’(pTrc-CKS/hepcidin)(3.王克坚，杨明，蔡晶晶.黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法[P].中国专利：200710008862，2007-4-20)以及毕赤酵母真核表达体系GS115(pIC9K/AS-hepc2)(4.蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚.黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性[J].厦门大学学报(自然科学版)，2009，48(5)：738-743)获得体外表达产物。但由于获得蛋白纯品工序复杂或技术有限等原因，造成了获得的重组抗菌肽hepcidin得率不高，或者抗菌谱研究不充分。因此，需建立更加高效的AS-hepc2基因表达载体，从而获得大量表达产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑鲷抗菌肽表达载体与构建方法及表达产物与制备方法。

黑鲷抗菌肽AS-hepc2的基因序列为：

ggctcattca ctgaggtgca agagccggag gagccaatga acaatgagag tccagttgct     60

gcacatgaag agaagtcaga ggagtcctgg aagatgccgt ataacaacag acacaagcgc    120

agccccgctg gttgtcgctt ttgctgcggt tgctgtccta acatgagagg atgtggtgtc    180

tgctgcaggttc                                                         192

黑鲷抗菌肽AS-hepc2的氨基酸序列为：