[发明专利]季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物疫苗制备领域，涉及利用经检定证明为WHO推荐的病毒株或相似株的H1N1型：IVR-148；H3N2型：NYMC X-175C；B型：B/Florida/412006流感病毒株制备用于预防季节性流感的流感病毒裂解疫苗的新工艺。

背景技术：

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过感染者含有病毒的飞沫以气溶胶的形式传染给易感者，具有高度传染性，容易引发大规模流行。

上一世纪以来已先后发生四次全球流感大流行，流感大流行具有发病率和病死率高，传播迅速和波及范围广的特点。仅1918年“西班牙”流感的大流行就导致至少2000万人死亡，超过第一次世界大战的死亡人数。流感流行带来了巨大的疾病负担，造成了较严重的社会影响。据2002年世界卫生组织公布的数据，估计全球每年流感病例达6亿～12亿。我国是流感的多发地，每年流感发病数估计可达上千万人。1957年、1968年和1977年三次大流行毒株均首发于我国。1997年在中国香港特别行政区人群中发现禽流感H5N1感染病例。1988年以来，世界卫生组织每年公布的流感疫苗病毒株约一半来自中国。中国已成为世界流感监测的前哨。

研究表明：流感病毒是一种很容易变异的病毒，当变异达到一定程度，从而导致一种新的流感病毒产生时，因人类不具备相应的抗体，而易引发大流行。

流感病毒属于正黏病毒科，典型毒粒呈球形，直径约为80-120nm，病毒最外部为病毒包膜，病毒包膜由基质蛋白、双层类脂膜和糖蛋白突起所组成。包膜内部为核衣壳，核衣壳包裹着病毒的遗传物质----单股负链RNA，其RNA共分为8个节段。基因组分节段是造成同型不同毒株间易产生基因重配的主要原因。且病毒的RNA聚合酶不具有纠错功能，所以病毒基因易发生变异。若两种不同亚型毒株感染同一个细胞，使其基因组发生重新排列，可引起抗原转变，导致新亚型的出现。另外，由于基因组自发的点突变，常引起抗原漂移。

根据流感病毒核蛋白NP和膜蛋白M1抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒可分为A、B、C三型。A型流感病毒根据其表面血凝素和神经氨酸酶结构及其基因特性的不同又分为许多亚型，目前已发现的血凝素有15个亚型(H1～15)，神经氨酸酶有9个亚型(N1～9)，它们均为位于病毒表面的糖蛋白，其中血凝素H1～3亚型和神经氨酸酶N1～2亚型的流感病毒常见于人类感染。

对于流感疫苗的研制，全世界进行开发的疫苗类型包括全病毒型、裂解型、亚单位型。佐剂包括有氢氧化铝、MF59。主要免疫途径是肌肉注射。目前经过WHO认可的工艺流程制备的疫苗主要有传统的全病毒灭活疫苗、病毒裂解疫苗和新一代的亚单位疫苗及减毒活疫苗。在以往的流感疫苗研制过程中，不少科学研究者求助于基因工程疫苗如重组疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗的研究，然而该种疫苗较低的免疫原性与保护率限制了其应用。基于目前防控新型流感疫情的需要，世界各国的研究单位仍主要致力于这三种传统疫苗的制备。

裂解型流感灭活疫苗是在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，经过不同的生产工艺去除裂解剂和纯化有效抗原成分制备而成的。

按照历史上流感大流行的规律，理论上最近几年应该进行这方面的准备，因此从WHO到国际上许多国家如美、欧等都在进行从策略上到技术上的准备。包括疾病的监测及预警、医疗能力的储备包括抗病毒药物的储备等；疫苗部分包括生产能力的评估、资源的充分利用、生产用毒株的可用性、生产周期、大流行疫苗的注册即国家管理部门系统的准备、疫苗的储备及供应等等。

中国是一个流感大国，参照国际上的信息及我国具体情况，国家也制定出的应对流感大流行的策略和措施。其中生产技术的储备，提高生产流感疫苗能力是必不可少的重要部分。目前国内的生产能力要在大流行时提供足够的疫苗还有很大差距，因此我公司对流感病毒裂解疫苗的研发具有较高的社会意义。

我国绝大多数流感病毒疫苗厂家的产品中添加硫柳汞防腐剂，本发明研制的流感病毒裂解型疫苗，不含硫柳汞防腐剂，其采用更为安全的2-苯氧乙醇作为防腐剂。另外由于本发明采用了复合裂解剂和新的纯化工艺，最终制备得到了杂质含量更少、HA含量更高的卵清蛋白、内毒素含量、总蛋白含量等质量指标远低于国家标准的流感病毒裂解疫苗。临床前动物试验结果表明，采用本发明的方法制备得到的流感病毒裂解型疫苗免疫原性高，具有较好的安全性。

发明内容：