[发明专利]季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，该方法包括按顺序实施的建立病毒种子批、接种与培养病毒、收获病毒、对病毒进行灭活处理、超滤浓缩、离心纯化、柱层析纯化、裂解病毒、二次纯化、过滤除菌、半成品配制的步骤，其中的病毒是甲1、甲3和乙型流感病毒株，其特征在于，其中的离心纯化步骤采用的是蔗糖速率区带离心法，包括将浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50％的上样量，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心3小时；其中的建立病毒种子批步骤包括：

(1)主代种子库建立：由索取的原始毒种传代制备，将毒种复溶并稀释，取稀释度为10³～10⁵的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0.2ml/胚，33～35℃培养48～72小时后收获尿囊液并混合，加等量脱脂牛奶后分装为0.2ml/支冻干后保存于-60℃以下，经检定合格即为主代种子批；自原始毒种到制成主代毒种传代不得超过2代；

(2)工作种子库建立：由主种子批毒种传代制备，将主代种子复溶，取稀释度为10³～10⁵的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0.2ml/胚，33～35℃培养48～72小时后收获尿囊液并混合，分装后冻存于-60℃以下，经检定合格即为工作种子批，自主代毒种到制成工作种子传代不得超过2代。

2.权利要求1所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心3小时后，将收集的病毒液用截留分子量为300KD的超滤膜进行超滤透析，以去除蔗糖，然后再进行接下来的柱层析步骤。

3.权利要求1或2所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于二次纯化包括蔗糖密度梯度离心和超滤浓缩步骤，蔗糖密度梯度离心包括将病毒裂解物以不超过离心腔容积50％的量上样，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心2小时。

4.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于二次纯化中的超滤浓缩步骤是将收集的离心后的裂解物用10KD的超滤膜进行超滤浓缩，以去除蔗糖和进一步去除裂解剂。

5.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于采用Triton X-100和去氧胆酸钠裂解病毒，Triton X-100及去氧胆酸钠的终浓度均为0.3％，裂解过程持续60～150分钟。

6.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于采用甲醛进行灭活处理。

7.权利要求9所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于将病毒尿囊液加入终浓度为0.02％的甲醛，置2～8℃条件下灭活16～24小时。

8.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于灭活后的收获液用截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩30-50倍，浓缩液取样进行细菌内毒素含量。

9.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于柱层析采用Sephrose-4FF凝胶层析纯化，洗脱液为0.01mol/L的PBS，收集第一峰。

10.采用权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗制备方法制备得到的疫苗，其特征在于所述疫苗不含硫柳汞防腐剂，其中的卵蛋白含量为不高于300ng/ml，内毒素含量为小于20EU/ml。