[发明专利]一种高效表达工程菌重组蛋白的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种高效表达工程菌重组蛋白的方法及其应用。

背景技术

本发明的发明人在前期的研究中，经过创造性的尝试和实验验证，得到了以大肠菌素为攻击端，可操作地连接其它识别靶细胞的识别多肽(天然或人工设计的)得到一系列新型重组多肽，如申请号为200910092128.4，发明名称为“一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用”中公开的新型抗生素PMC-AM1具有广谱抗生性能，对脑膜炎双球菌，多重耐药绿脓杆菌、耐万古霉素肠球菌、耐甲氧西林金葡菌都具有较现有抗生素效果明显的抗菌效果；申请号为200910157564.5，名称为“一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用”中公开了一系列抗葡萄球菌新型抗生素，如PMC-SA1、PMC-SA2、PMC-SA3、PMC-SA4、PMC-SE以及PMC-PA六种新型抗生素。在体外和体内试验中，表现出比现有抗生素、抗真菌抗生素、化疗药物更为优越的靶向性和杀伤效率，这些新型抗生素不仅抗菌效果明显，且具有其它现有抗生素不能比拟的生物安全性和抗耐药性。

由于上述系列重组蛋白是一类以水溶性蛋白，一般由600余个氨基酸残基组成，但在该类蛋白的肽链中靠近羧基端有一段40个氨基酸残基组成的疏水区段。相较于其他结构单一的水溶性蛋白而言，该蛋白的装配和表达更为困难，不可避免地影响其生产率，改善上述重组蛋白的表达工艺流程，提高蛋白的表达率，解决了大规模生产以将上述系列重组蛋白推向实际临床应用和实践中存在的技术难题。

发明内容

本发明针对发明人在现有专利申请中公开的重组多肽的结构和性质特点，提供一种高效率表达工程菌蛋白的方法。

一种高效表达工程菌重组蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)重组突变质粒转染大肠杆菌pET系统工程菌中得到阳性单克隆菌落，

(2)对阳性单克隆菌落进行增菌得到种子菌液，诱导种子菌液大量增菌生长，

(3)分离含有表达的目的重组蛋白的菌体上清液，提纯菌体上清液中的重组蛋白，

其特征在于：所述大肠杆菌pET系统工程菌指E.coli B834(DE3)。

所述大量增菌采用的培养基为NaCl 6.0～6.7g/L，蛋白胨25.0g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖0.6～2.0g/L，Na₂HPO₄·7H₂O 6.8～18.3g/L，KH₂PO₄ 3.0～4.3g/L，NH₄Cl 1.0～1.4g/L，MgSO₄0.2～0.4g/L，CaCl₂0.01g/L，甲硫氨酸0～40mg/L。

所述大量增菌采用的培养基为NaCl 6.0g/L，蛋白胨25.0g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖2.0g/L，Na₂HPO₄·7H₂O 6.8g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄0.2g/L，CaCl₂0.01g/L，甲硫氨酸0～40mg/L。在以E.coli B834(DE3)为工程菌的工艺中，甲硫氨酸为40mg/L。

所述诱导采用热冲击诱导，操作方式如下：种子菌液入罐后，30℃起始生长2～3小时，测OD值达0.4-0.6时，于42℃热冲击30分钟，然后将温度下调至37℃，再生长1.5-2小时后收菌。

所述热冲击诱导步骤中，在所述培养基中加入终浓度为0.5mM的PTG。

所述提纯菌体上清液中的重组蛋白，采用CM离子交换柱，其中上样量为上清液蛋白质量/凝胶颗粒体积为2.5mg/ml。

所述提纯菌体上清液中的重组蛋白，采用CM离子交换柱，洗脱所用的硼酸缓冲液中NaCl浓度为0.2M。

所述重组突变质粒指pBHC-SA1、pBHC-SA2、pBHC-SA3 pBHC-SA4、pBHC-SE，pBHC-PA或pBHC-PorA1。

上述任一方法在制备重组多肽PMC-SA1、PMC-SA2、PMC-SA3，PMC-SA4、PMC-SE，PMC-PA或PMC-AM中的应用。