[发明专利]一种高效表达工程菌重组蛋白的方法及应用

权利要求书

1.一种高效表达工程菌重组蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)重组突变质粒转染大肠杆菌pET系统工程菌中得到阳性单克隆菌落，

(2)对阳性单克隆菌落进行增菌得到种子菌液，诱导所述种子菌液大量增菌生长，

(3)分离含有表达的目的重组蛋白的菌体上清液，提纯菌体上清液中的重组蛋白，

其特征在于：所述大肠杆菌pET系统工程菌指E.coli B834(DE3)。

2.根据权利要求1所述的方法，所述大量增菌培养基为：NaCl 6.0～6.7g/L，蛋白胨25.0g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖0.6～2.0g/L，Na₂HPO₄·7H₂O 6.8～18.3g/L，KH₂PO₄ 3.0～4.3g/L，NH₄Cl1.0～1.4g/L，MgSO₄ 0.2～0.4g/L，CaCl₂0.01g/L，甲硫氨酸0～40mg/L。

3.根据权利要求2所述的方法，所述大量增菌培养基为NaCl 6.0g/L，蛋白胨25.0g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖2.0g/L，Na₂HPO₄·7H₂O 6.8g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄0.2g/L，CaCl₂0.01g/L，甲硫氨酸40mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，所述诱导采用热冲击诱导，操作方式如下：种子菌液入罐后，30℃起始生长2～3小时，测OD值达0.4-0.6时，于42℃热冲击30分钟，然后将温度下调至37℃，再生长1.5-2小时后收菌。

5.根据权利要求4所述的方法，所述热冲击诱导步骤中，在所述培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG。

6.根据权利要求1所述的方法，所述提纯菌体上清液中的重组蛋白，采用CM离子交换柱，其中上样量为上清液蛋白质量/凝胶颗粒体积为2.5mg/ml。。

7.根据权利要求1所述的方法，所述提纯菌体上清液中的重组蛋白步骤中，采用CM离子交换柱，洗脱所用的NaCl浓度0.2M。

8.根据权利要求1～7任一所述的方法，所述重组突变质粒指pBHC-SA1、pBHC-SA2、pBHC-SA3 pBHC-SA4、pBHC-SE，pBHC-PA或pBHC-PorA1。

9.权利要求1～8任一所述方法在制备重组多肽PMC-SA1、PMC-SA2、PMC-SA3，PMC-SA4、PMC-SE，PMC-PA或PMC-AM中的应用。