[发明专利]一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途。

背景技术

(一)胚胎干细胞简介

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

(二)干细胞多能性(pluripotency)的特点：

胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为“多潜能”干细胞，此外，胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是：ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状(人胚胎干细胞较扁平，而小鼠胚胎干细胞较为隆起，细胞界限不明显)。具有AP酶活性，特异地表达SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEA1，而人胚胎干细胞不表达SSEA1)，及Oct4，Nanog，Sox2，rex1(ZFP42)，GDF3，lin28，mbd2，TEGF1等标志性基因。此外，还可以在悬浮培养条件下，形成胚胎小体(Embryonid bodies)结构，并发生自发分化，EB形成6-9天后贴壁培养，可检测到向内、中、外三个胚层分化的细胞。

(三)胚胎干细胞的研究

哺乳动物在正常情况下永远不会发生的事情是细胞的“去分化”——细胞倒转发育的进程，回归为一种更加原始的类型。事实上对于这条规则的唯一例外是肿瘤细胞，相比于其来源的组织细胞，它们的分化程度比较低。不幸的是，一些肿瘤细胞会无止境的分裂，显示了永生化的特点，而多能性细胞也具有相似的特点。

直到最近，将一个正常成体细胞内的生物钟倒转的唯一办法是通过一种精细操作，让细胞回归成为胚胎样细胞的状态，这个过程被称为细胞的重编程。实现重编程的最古老的方法是体细胞的核移植技术，或者称为“克隆”，其具体操作是将一个正常成体细胞内的遗传物质通过显微注射进入卵细胞内，而卵细胞本身的DNA之前被去除掉。这种DNA与卵细胞形成的杂合体能够发育成为早期胚胎，从这种早期胚胎中可以提取多能性的干细胞。

自从1997年多利羊的诞生和1998年首次分离得到人类胚胎干细胞以来，核移植技术作为一种可以量身定制获得多能性细胞的途径，进而能够移植替换疾病受损组织和创伤组织，受到了广泛的关注。卵细胞内的某些因子(我们了解得还很少)的确将成年供体细胞内的遗传物质变得年轻了，甚至包括端粒。端粒就像一顶帽子一样保护着染色体的末端，并随着年龄的增长逐渐变短，但重编程仍能让端粒保持年轻化的状态。尽管克隆技术在动物体内取得了长足的进展，但将之用于生成人类胚胎干细胞的努力仍然是不成功的。

(四)诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究

2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4，Sox2，c-Myc和KLF4)成功地将其诱导重编程成为全能性的干细胞，其性质和胚胎干细胞类似。(Takahashi and Yamanaka，2006)从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全能性。