[发明专利]一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产α-酮基丁酸的方法，具体地说，涉及利用以含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以L-苏氨酸作为底物，生产α-酮基丁酸的方法。

背景技术

α-酮基丁酸是一种重要的中间体，可应用于化学和药物等领域。例如，α-酮基丁酸可用于生产L-异亮氨酸^【1】、1-丙醇^{【2】【3】}、食品香料组分^【4】以及D-α-羟基丁酸^【5】。其中，D-α-羟基丁酸可用来制备azinothricin家族抗癌抗生素以及高聚物聚α-羟基丁酸[P(2HB)^【6】。另外，α-酮基丁酸可转变为L-α-氨基丁酸，而后者是合成左乙拉西坦等抗癫痫药物的手性前体^{【7】【8】}。

α-酮基丁酸的生产方法分为传统的化学法和微生物催化法。前者指的是由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解而成α-酮基丁酸^【9】。而文献中报道的后者包括以下几种：以1，2-丁二醇为起始底物，以马红球菌IF03730全细胞为催化剂，最终产物浓度为153.8毫摩尔/升，摩尔转化率为68％，生产强度为4.8毫摩尔/升/小时^【10】；以巴豆酸为起始底物，以锇和恶臭假单胞菌全细胞为催化剂，最终产物浓度为47毫摩尔/升，生产强度为9.4毫摩尔/升/小时^【9】；以DL-2-羟基丁酸为底物，以施氏假单胞菌SDM为催化剂，最终产物浓度为434.9毫摩尔/升，摩尔转化率为91.5％，生产强度为18.1毫摩尔/升/小时^【11】；以苏氨酸为底物，粗糙脉胞菌的ilv-3突变体发酵产α-酮基丁酸78.4毫摩尔/升，摩尔转化率＞90％，生产强度为0.7毫摩尔/升/小时^【4】。1，2-丁二醇、巴豆酸及DL-2-羟基丁酸只能通过化学法获得，不能实现α-酮基丁酸的绿色生产。而苏氨酸可以通过微生物发酵大规模获得，全世界L-苏氨酸的产量达到20,000吨^【12】，非常适合作为α-酮基丁酸的起始底物。由L-苏氨酸转化生成α-酮基丁酸，经过了L-苏氨酸脱水酶催化的脱氨和脱水过程^【13】。

L-苏氨酸脱水酶(L-苏氨酸脱氨酶)分为合成型和降解型两种。合成型L-苏氨酸脱水酶在有氧条件下组成性表达，受到L-异亮氨酸的抑制；降解型L-苏氨酸脱水酶厌氧条件下受L-苏氨酸诱导表达，不受L-异亮氨酸的抑制^{【14】【15】【16】}。经检索发现，利用以含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以L-苏氨酸作为底物，生产α-酮基丁酸的方法还未见报道。

参考文献

【1】Eggeling，I.，Codes，C.，Eggeling，L.，Sahm，H.，1987.Regulation of acetohydroxy acid synthase in Corynebacterium glutamicum during fermentation of α-ketobutyrate to L-isoleucine.Appl.Microbial.Biotechnol.25，346-351.

【2】Atsumi，S.，Hanai，T.，Liao，J.C.，2008.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.Nature 451，86-89.

【3】Shen，C.R.，Liao，J.C.，2008.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways.Metab.Eng.10，312-320.

【4】Zurbriggen，B.D.，Rekhif，N.，Mehlmann-De-Campos，M.，Lerch，K.，2006.Production of α-ketobutyrate.U.S.patent 7144715.