[发明专利]利用未萌发玉米种子转化外源基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业种植技术领域，涉及一种遗传转化技术。

背景技术

植物遗传转化是指把外源核酸片段转入植物细胞特定部分(细胞核、叶绿体等)，时期在受体细胞或再生植株中稳定表达，并通过有性或无性繁殖传递给后代。利用遗传转化技术，可打破种属间的生殖隔离，创造出常规育种技术很难得到的生物新品种。

迄今为止，植物遗传转化技术可分为三大技术体系，即农杆菌介导的遗传转化、基因枪轰击法和原生质体为受体的遗传转化。自1983年Zambrysk等采用农杆菌转化获得世界上第一株转基因植株以来，众多研究表明，根瘤农杆菌Ti质粒转化系统是目前机理最清晰、技术最成熟的遗传转化技术。农杆菌介导的遗传转化，已被广泛应用在拟南芥、烟草、玉米、水稻、大豆、棉花、小麦、大麦、向日葵、花生等众多植物的转基因研究中。但其仍未摆脱其转化率低，重复性差，需要无菌操作等缺点。特别是玉米的农杆菌介导的遗传转化，不但遇到上述问题，而且其转化效率还很大程度的依赖于受体材料的基因型和取材部位及取材时间。造成了转基因玉米研发的成本高昂的现状。近年来，研究人员对玉米遗传转化技术进行了探索，建立了包括芽尖转化技术、胚芽鞘注射法转化技术和合子转化技术等玉米遗传转化技术体系，但是仍未完全解决玉米遗传转化中依赖无菌操作、受取材时间限制、操作步骤复杂要求精度高等问题。如何改进玉米遗传转化技术，使其适合规模化和产业化研发，已成为业内关注的重要问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用未萌发玉米种子转化外源基因的方法，从而建立起一种简便、高效的玉米遗传转化方法。

本发明应用农杆菌介导的遗传转化原理，以玉米种子未萌发胚的胚芽分生组织为受体细胞，对玉米种子进行打孔，使胚的胚芽生长点部分得以暴露，再将含有外源基因的农杆菌滴入孔内，再对孔口封闭，正常播种，种子萌发过程中利用农杆菌侵染的特性，实现对胚芽生长点细胞的遗传转化，获得转基因植株。

本发明的技术内容包括以下步骤：

1、玉米种子转化前处理：将玉米种子在蒸馏水中浸泡1-2天，使种皮、胚吸水软化，以便于后续操作，根据玉米种子的结构，选择玉米种子胚位置钻孔，孔径为1.5-2.5毫米，孔深为2-3毫米，经过打孔处理，可使玉米种子中胚芽位置暴露，并造成生长点位置的轻度损伤，以易于进行遗传转化共培养。

2、农杆菌侵染：取6-8微升农杆菌液(含有表达载体质粒，该质粒中包含功能基因和抗除草剂基因)，滴入孔中，静置5分钟后，在玻璃罐中，0.05MPa条件下进行负压处理10分钟，使菌液浸入到籽粒细胞间隙，负压处理重复三次后，再在孔中滴入6-8微升菌液，用滤纸吸干玉米种子表面残留菌液，封闭孔口。

3、种植及养护：侵染后的玉米种子，可正常种植于土中。保证充分的水分补给，并保证环境温度在20-25摄氏度之间，种子可在3-5日内正常萌发，萌发过程中，种子内部的农杆菌可对胚芽生长点细胞完成侵染。

4、鉴定转基因植株：由于侵染过程中使用的表达载体中含有抗除草剂基因，因此可利用相应除草剂的抗性作为筛选标记。在玉米幼苗生长至5片叶后，可通过叶片涂抹或喷施除草剂的方法初步鉴定转基因植株。

本发明利用未萌发的玉米种子作为转化受体，不需要经过萌发处理，降低了操作难度；通过在籽粒上打孔的方式，使胚的胚芽生长点部位暴露，有利于农杆菌与其充分接触，提高转化效率；同时为农杆菌进行转化创造了一个小的腔体空间，辅以负压处理，实现了不依赖于无菌操作和组织培养的遗传转化，并提高了转化几率；本发明将籽粒萌发和农杆菌侵染过程有机的结合，利用细胞生长的活跃期进行转化，大大提高了转化效率。

本发明采用玉米种子为受体材料，通过在籽粒上打孔进而进行侵染，并伴随种子萌发实现遗传转化，使得该方法具有取材方便，无需萌发后对幼苗进行操作，不需无菌条件的组织培养，无需昂贵设备设施，不受季节限制，后期养护简单等诸多优点，是一种简便、高效的玉米遗传转化新技术。

具体实施方式

例1、利用未萌发玉米种子转化法转化玉米自交系郑58

(1)玉米种子前处理：选择玉米自交系郑58为实验材料，将郑58种子在室温条件下蒸馏水中浸泡2天待用。此时玉米种子表现出种皮软化、胚部位吸水后稍稍膨大。选择玉米种子胚中轴线上约四分之一位置(此部位有一小突起，可作为钻孔位置的参照)钻孔，孔径为2毫米，孔深为3毫米。