[发明专利]一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法无效

专利信息
申请号: 201110372844.5 申请日: 2011-11-22
公开(公告)号: CN102399267A 公开(公告)日: 2012-04-04
发明(设计)人: 刘克海;朱青;高申;王晓宇 申请(专利权)人: 上海海洋大学
主分类号: C07K7/08 分类号: C07K7/08;C12N15/63;C08G81/00
代理公司: 上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙) 31262 代理人: 巫蓓丽
地址: 201306 上海市*** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 功能 修饰 基因 载体 及其 制备 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及基因载体技术领域,具体地说,是一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法。

背景技术

基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法,因肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变,所以基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望的手段,也是研究最为活跃的领域。基因治疗有三个重要环节,即目的基因、转基因载体和靶细胞,其核心技术是基因导入系统的建立。现阶段基因治疗面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等缺点,因此,非病毒载体近年来发展迅速,尤其是阳离子聚合物。其中,聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体,富含阳离子,具有强大的缓冲能力,有较强结合DNA和黏附细胞的能力,可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达。然而,PEI作为基因载体使用仍存在二个突出问题:第一,转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低,但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离,造成转染效果差;分子量在20 kDa以上的PEI虽具有较理想转染效率,但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性,致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二,聚乙烯亚胺靶向性差。它是利用自身所带的正电荷,与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合,所以细胞的选择特异性差,解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此,如何将PEI改造成细胞毒性低、靶向性强、转染效率高的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。

普朗尼克P123(Pluronic P123)是一种由中部疏水的聚氧丙烯链侧面连接两段亲水聚氧乙烯(EO)构成的非离子式三嵌段共聚物。该物质无毒、无刺激、无免疫原性,可通过化学交联的方法连接PEI,尤其低分子量PEI(如PEI 600/800/2000 kDa),以形成多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物,该衍生物可保证较高转染效率,转染进入体内细胞后,这些交联的化学键又可以通过水解等反应断开,高分子量PEI衍生物断裂成易代谢的低分子量低毒性的PEI,这就使得其在保证一定转染效率的前提下,大大降低了高分子PEI所带来的细胞毒性;另一方面,P123 的亲水亲油平衡值适中,同时具有亲水性的聚氧乙烯(EO)链和疏水性的聚环氧乙烷(PO)链,它在水中可自发形成稳定的多分子球形胶束样结构,该胶束尺寸可达纳米级,因此适宜基因药物在体内的传输。

整合素在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用,有研究表明,在肿瘤诱导的新生血管中表达丰富的整合素αvβ3对肿瘤血管的生成起重要作用。利用整合素αvβ3在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点,可将其作为基因治疗的靶点,针对整合素亚基设计一段特异的反义寡核苷酸,并通过转基因载体将其转染入肿瘤细胞中,从而调节整合素αvβ3介导的生物学作用。

RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽,广泛存在于生物体内,是整合素和其配体相互作用的识别位点,能以一定的亲和力结合整合素αvβ3,成为肿瘤治疗新的靶向策略,RGD肽在肿瘤治疗中的应用已成为研究热点。

细胞穿膜肽(Cell-Penetrating Peptides,CPPs)能够有效地引导蛋白质甚至纳米粒子进入细胞,并可靶向细胞核,其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。研究发现:全长86个氨基酸的细胞穿膜肽TAT中49-57位氨基酸残基组成的线性序列即可完全行使细胞穿膜功能,TAT(49-57)氨基酸序列为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RKKRRQRRR),这是TAT肽既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。

因此,理论上可将RGD短肽与细胞穿膜肽TAT(49-57)连接,合成具有靶向于整合素αvβ3和促进载体穿膜的含RGD和TAT(49-57)的双功能肽,用于修饰PEI衍生物,提高其肿瘤细胞选择性,又可促进载体穿膜,从而增加DNA的转染效率。

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