[发明专利]一种稳定、高效从红麻叶片中分离蛋白质的双向电泳方法

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种红麻蛋白质组学技术，更具体地涉及一种稳定、高效从红麻叶片中分离蛋白质的双向电泳方法。

背景技术

红麻(Kenaf)是锦葵科(Malvaceae)木槿属（Hibiscus）一年生韧皮纤维作物，公元前4000年的非洲苏丹就已栽培，红麻作为天然纤维作物，具有生长速度快、抗逆性强、适应性广等特点，巨大的生物产量为树林的3-4倍，极强的二氧化碳吸收能力为森林的4-5倍，是发展低碳经济的优势作物。红麻纤维除传统上作为加工麻绳、麻袋、地毯等的原料外，还是加工汽车内饰、板材、麻碳等的良好材料，其纤维经变性可与棉花混纺为面料，具有吸湿、透气、抑菌等生物功能。

澳大利亚科学家 Wilkins等首先提出了蛋白质组的概念，蛋白质组是生物体内一套基因组表达的所有蛋白质总称，蛋白质组研究是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体研究，在蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用。随着植物功能基因学的发展，蛋白组学技术已在水稻、拟南芥等模式植物中得到广泛的应用。

双向电泳技术最早由 O’Farrell、Klose、Scheele等于1975 年创立，至今已经历了30多年的发展，基本技术已较为成熟。为了更深入研究红麻发育、生长、抗逆等方面的分子机理，从蛋白组水平上探究其基因表达差异显得尤为重要，而红麻蛋白组学研究起步较晚，国内鲜有报道，本发明首先从几个方面比较了TCA-丙酮法、尿素-硫脲法、酚抽提法等方法提取红麻叶片蛋白的效果，以期找到最适合用于红麻双向电泳的蛋白提取方法。在从红麻蛋白质的提取、IPG胶条pH范围选择、蛋白上样方式、上样量、分离胶浓度这几个主要方面优化了红麻蛋白组双向电泳实验条件，最终提供了一种高效、稳定从红麻叶片中分离蛋白质的双向电泳方法，为进一步开展红麻蛋白组学的研究奠定工作基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、稳定从红麻叶片中分离蛋白质的双向电泳方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明的一种稳定、高效从红麻叶片中分离蛋白质的双向电泳方法，采用pH值为8.0的Tris-饱和酚抽提红麻叶片中的蛋白质，然后进行双向电泳，双向电泳的条件如下：第一向电泳：红麻蛋白质上样量为1.4mg，使用24CM，pH值为4-7的IPG胶条、pH值为4-6.5的IPG buffer；第一向电泳参数设置为：20℃、50μA/strip、50V 12h 、200V 1h 、500V 1h 、1000V 1h 、梯度1000V～8000V 1h 、8000V 52000vhr；第二向电泳中采用12%分离胶来纵向分离蛋白，第二向电泳参数设置为：15℃、10μA/strip 1h 、15μA/strip。

采用pH值为8.0的Tris-饱和酚抽提取红麻叶片中的蛋白质的具体操作为: 取1g红麻新鲜叶片，置于冰冷的研钵中，加入聚乙烯吡咯烷酮PVP，用液氮进行研磨45min，加入5ml提取液，提取液配方：100mmol/LTris、50mmol/L抗坏血酸、100mmol/L氯化钾、50mmol/L硼砂、1％Triton X-100、2%β-巯基乙醇，继续研磨15min，加入等体积的pH 8.0 Tris-饱和酚，涡旋， 15000r/min，4℃离心15min；取酚层，加入6倍体积0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液，-20℃静置过夜，15000r/min，4℃离心15min，弃上清液，沉淀用-20℃预冷的含2％β－巯基乙醇的甲醇溶液洗涤2次，沉淀真空干燥成干粉。

第一向电泳中采用主动上样方式上样。

本发明的显著优点：

红麻叶片含多糖、色素、酚类、核酸等比较多，这些因素极易引起蛋白聚焦时间延长、水平拖尾、背景污染等问题。本发明在磨样时加入了适量不溶性的聚乙烯吡咯烷酮，减少了植物中色素、酚类和醌类等次生代谢物质的干扰。运用本发明中的饱和酚提取法提取的红麻叶片蛋白质杂质含量低，蛋白纯度和得率都较高。所以在等电聚焦时，单根胶条电流才20 mA,保证了聚焦过程的顺利进行。本发明优化的红麻双向电泳体系重复性极好、实验结果较稳定、双向凝胶图谱蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚。在24 * 16cm的凝胶上平均可检测到大概1300个蛋白质点，此发明为进一步开展红麻及其麻类的蛋白组学和分子生物学的研究奠定工作基础。

附图说明

图1为三种提取方法提取的红麻叶片蛋白的双向电泳图谱；其中A.TCA-丙酮法：B.尿素-硫脲法：C.酚抽提法。