[发明专利]一种从发酵液中分离提取高纯度布雷菲德菌素A的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种从发酵液中分离提取高纯度布雷菲德菌素A的方法。

(二)背景技术

布雷菲德菌素A(Brefeldin A)是一种天然存在的大环内酯类抗生素，化学名[(1R，2E，6S，10E，11as，14aR)-1，6，7，8，9，11a，12，13，14，14a-Decahydro-1，13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-one]，分子式为C₁₆H₂₄O₄，分子量约280，化学结构式如下：

1958年，首次报道从Penicillium decumbens发酵液中分离得到布雷菲德菌素A(Singleton等，1958)。早期研究发现，布雷菲德菌素A抑制蛋白质由内质网向高尔基体复合物转运过程，具有抗细菌、抗真菌和抗病毒性质。布雷菲德菌素A作为一种蛋白转运抑制剂，能够影响蛋白质转运、加工过程，已成为细胞生物学家研究哺乳动物细胞信号转导途径的重要分子工具，具有一定的市场需求。1963年，NCI发现，在小鼠肿瘤模型上布雷菲德菌素A表现出抗肿瘤活性，小鼠的LD₅₀大于200mg/kg。研究发现，布雷菲德菌素A通过不依赖于p53凋亡机制诱导人前列腺癌细胞凋亡，Akira等联合使用低剂量布雷菲德菌素A提高吉西他滨(Gemcitabine)对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2细胞线的作用效果。此外，布雷菲德菌素A及其化学衍生物具有除草活性。

布雷菲德菌素A生产方法分为化学合成法和发酵法。化学法合成布雷菲德菌素A具有反应步骤冗长、收率低等缺陷；发酵法生产布雷菲德菌素A具有高效和环境友好的特点。文献报道产布雷菲德菌素A的菌种包括青霉属(Penicillium)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、蓝青霉(Penicillium cyaneum)、苜蓿假盘菌(Phyllosticta medicaginis)、壳二孢属(Ascochyta)、拟青霉(Paecilomyces sp.)、布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、分支孢属(Cladosporium sp.)、链格孢菌属(Alternaria zinniae)、茎点霉属(Phoma)、踝节菌属(Talaromyces sp.)。

美国专利U.S.3896002公开了产布雷菲德菌素A的菌株苜蓿假盘菌(P.medicaginis)及布雷菲德菌素A制备过程。McCloud等(1995)在中试规模上，E.brefeldianum ATCC 58665合成布雷菲德菌素A发酵单位达到169mg/L。赵玉芬等进行了布雷菲德菌素A产生菌选育和布雷菲德菌素A结构改造工作，她们报道的布雷菲德菌素A小试发酵水平为151.6mg/L。除制备工艺外，改性是布雷菲德菌素A研究的另一个热点，美国专利U.S.6,362,218、U.S.5,824,674、U.S.5,696,154、U.S.5,112,607、U.S.4,608,078公开了布雷菲德菌素A的衍生化反应及衍生物的生物学活性。

目前关于布雷菲德菌素A分离纯化的文献报道较少。Kim和Kochevar等(1995年)利用反相层析技术从发酵液中分离布雷菲德菌素A，但该项工作未报道具体的纯化效果，而且，C18反相硅胶对布雷菲德菌素A的吸附能力较弱，且该填料售价高，导致整个分离工艺的效率低、经济性差。Gao等(2010年)建立高速逆流色谱(HSCCC)和电喷雾质谱(ESI-MS)联用的方法提取布雷菲德菌素A，该方法存在单批处理量小、成本高等缺陷，不能满足大规模的高纯度布雷菲德菌素A生产的要求。发明人在中国发明专利CN200810163775.5中报道了蒸发结晶工艺，蒸发结晶技术从发酵液中制备布雷菲德菌素A工艺单次结晶产物纯度低，呈淡黄色，必须依赖重结晶才能制备99.0％纯度的晶体。而且，蒸发结晶制备的布雷菲德菌素A晶体晶型不规则，仍含有一定的色素残留，晶体品质较差，不能满足生物试剂对品质的高要求。

(三)发明内容

本发明的目的是克服现有技术上的缺陷与不足，提供一种设备简单、分离过程环境友好、产物综合收率高、晶体纯度高(99％以上)、晶体规则且工艺易控制和放大的布雷菲德菌素A的提取方法。

本发明采用的技术方案是：