[发明专利]大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法

权利要求书

1.一种大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于：采用大果红花油茶树芽苞和叶片作为外植体，消毒，配制分化培养基，壮苗培养基，用定向聚丙烯薄膜袋作为培养皿器，接种，培养，其技术工艺步骤如下，

(1)采外植体，选定大果红花油茶树的嫩枝条剪下，连芽和叶片保湿保鲜采集，选取芽苞和嫩叶放清水冲洗，然后用饱和洗衣粉水清洗，再用流动的清水漂洗2～5分钟，

(2)无菌分化，把漂洗干净的油茶树芽苞或嫩叶片作为外植体，在无菌接种室工作台上用72％～75％的酒精消毒10～15秒后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1％～0.2％的升汞中消毒8～15分钟，再用无菌水漂洗4～6次，去掉外表杂物。把所消毒的芽苞、叶片放到150倍以上的电子显微镜下，用解剖刀切割外表的杂物，清理外表杂物后取下最顶的芽尖0.2～0.25mm组织，用接种针接种到分化培养基上培养15～20天得到小植株，所述的分化培养基每升含椰子汁50～150ml，蔗糖15～45g，卡拉胶6～10g，肌醇50～150mg，甘氨酸1～3mg，烟酸0.1～0.35mg，D-泛酸钙0.1～0.54mg，吡哆辛盐酸0.2～3.5mg，生长素0.09～0.25mg，分裂素6BA0.1～0.3mg，羟烯腺嘌呤0.1～0.3mg，烯腺嘌呤0.01～0.03mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分，

(3)快速增殖，培养15～20天后，将诱导出的小植株切割成0.3～0.5mm后接入新的分化培养基中，多次继代采用分化培养基，在每次转袋过程中，不断淘汰白化苗和污染袋苗，剪除枯黄叶片，经3～5次转袋培养后，得到的小植株再进行壮苗培养，

(4)壮苗培养，将无菌分化增殖获得的小植株接种到壮苗培养基上培养60～80天得到小苗，所述的壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.1～0.5g，蔗糖10～35g，卡拉胶6～10g，a-萘乙酸0.2～5.0mg，肌醇20～120mg，盐酸硫胺4.5～15mg，甘氨酸1.5～6.0mg，烟酸0.5～5.5mg，吲哚丁酸0.1～3mg，D-泛酸钙1～6mg，吡哆辛盐酸0.4～1.5mg，生长素0.09～0.25mg，苹果汁10～15g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

2.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)分化培养基每升含椰子汁100ml，蔗糖28g，卡拉胶8g，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.25mg，D-泛酸钙0.44mg，吡哆辛盐酸1.2mg，生长素0.15mg，分裂素6BA0.1mg，羟烯腺嘌呤0.2mg，烯腺嘌呤0.02mg，其余为MS培养基中的1/2大量元素和微量元素成分。

3.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(4)壮苗培养基每升含水解酪蛋白0.12g，蔗糖22g，卡拉胶8g，a-萘乙酸0.8mg，肌醇60mg，盐酸硫胺6mg，甘氨酸3.0mg，烟酸1.5mg，吲哚丁酸0.3mg，D-泛酸钙1.5mg，吡哆辛盐酸0.8mg，生长素0.12mg，苹果汁12g，其余为MS培养基中的1/2大量元素和1/2微量元素成分。

4.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)～(4)中所用的培养基PH为4.5～7.5，培养温度18～32℃，每天光照6～16小时，光照度800～2500Lx，芽尖为芽苞生长点0.1～0.5mm组织，叶片为顶尖叶片1/2处0.1～0.8mm组织，小植株的高度最好为1～3cm，小苗最好为苗高3～8cm，每株苗有2～8条根，无变异苗，白化苗。

5.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(2)～(4)中所用的培养基均分装入薄膜袋中，每袋20ml，分装好后密封、高温消毒10～20分钟，取出放在无菌室降温贮存，在无菌室的超净工作台上接上对应的外植体或小植株后，用封口机把接好种的培养基袋封口，再放到培养室培养，培养基分装的薄膜袋，均为定向聚丙烯薄膜袋。

6.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于步骤(4)当小苗形成的植株长至3～8厘米时，将培养袋苗转移到自然光下炼苗7～14天，然后将其从袋中取出，洗净根部的培养基，移至装有营养土的营养杯栽培，经2～8个月生长得到中苗，成为生产栽培的种苗。

7.如权利要求1所述的大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，其特征在于中苗最好为苗高50cm以上，每株苗有分枝2～8条，有3～10条根以上，须根多，叶片厚浓绿，无病虫，无变异苗，白化苗。