[发明专利]一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法。

(二)背景技术

酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近几年酶工程研究的重点。

酶的固定化，即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。依据酶的性质及用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法这几种。

嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27)是一种存在于嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)中的耐热性中性金属蛋白酶，含有4个钙离子和1个锌离子。其曾被用来研究卵传铁蛋白的结构，因为嗜热菌蛋白酶可以完全消化N端叶却留下大多数的C端叶免受破坏。嗜热菌蛋白酶不但广泛应用于肽键的水解中，特别是水解亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等氨基酸的疏水性的或大的氨基侧链的N端，而且其还催化肽键的形成，特别是催化人造甜味剂阿斯巴甜的合成。阿斯巴甜是一种二肽甜味剂，甜度大约是蔗糖的200倍，其味如白糖，不腻不苦；低热量可减肥；不会使血糖升高，适合于肥胖症、糖尿病和心血管病人食用；不被微生物发酵、不怕发霉，无虞龋齿，现在在100多个国家中被广泛用于食品与饮料中。采用酶催化此甜味剂的合成，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，使反应条件变的温和，从替代传统化学合成工艺催化剂的角度，该酶催化的反应具有很强的绿色属性，对传统化学工艺的绿色化学改造有着重要意义，因而该酶具有广阔的应用前景。

固定化能够改善酶的性质，使固定化酶比游离酶具有更好的稳定性和更高的使用效率，并且使酶能够回收利用，极大节约生产成本。但是由于嗜热菌蛋白酶溶解性低(1.0～1.2mg/ml)又只有9个氨基(嗜热菌蛋白酶通过氨基与载体共价连接)其共价固定化存在很大的困难。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种简单，快速，高效的嗜热菌蛋白酶共价固定化方法，该共价固定化是通过对苯醌交联剂与酶及载体的共价连接实现的，最终获得固定化酶产品，获得了性能比嗜热菌蛋白酶自由酶大为改善的嗜热菌蛋白酶固定化酶。

本发明采用的技术方案是：

一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法，所述方法包括：

(1)载体活化：将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2浸渍在0.5～2.5mM的对苯醌溶液中，在20～30℃、100～200rpm的条件下振荡活化1～3小时，离心，取沉淀依次用20～30％乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；

(2)酶的固定化：将活化的载体液，按40～100mg嗜热菌蛋白酶(自由酶)/g MCFs-NH₂的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18～20h或者在0～7℃、20～50W微波条件下照射2～4min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；

步骤(1)中所制得的氨基化的MCFs载体是本领域常规的氨基化的介孔泡沫硅载体，其孔径约为26nm。

步骤(1)和(2)中所述MES-NaOH溶液组成如下：NaCl 2～5M，ZnCl₂ 10～30mM，MES-NaOH 0.01～0.05M，pH 7.0～7.5，溶剂为水。

本发明在固定化时加入2～5MNaCl可以使嗜热菌蛋白酶的溶解性提高约10倍，使得嗜热菌蛋白酶可以充分分散在溶液中不至于聚集在一起从而能很好地与载体共价连接。

目前微波辐射在有机合成化学中的应用广泛受到关注，其可以大大地加快反应的进行并有效地提高产率。微波对物质分子的作用是直接作用于分子内部的。物质分子偶极振动同微波振动具有相似的频率，在快速振动的微波磁场中，分子的偶极振动尽力同磁场振动相匹配，而分子的振动又往往滞后于磁场，物质分子吸收电磁能以每秒数十亿次高速振动从而加速分子间的作用。其中极性物质受到微波的作用更加明显，而蛋白质和多肽都是典型的极性分子，所以微波能够加速嗜热菌蛋白酶与载体的共价连接。因此研究中性盐增溶和微波辐射强化嗜热菌蛋白酶固定化具有重要意义，可以将酶的固定化技术提高到一个新的水平。