[发明专利]一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及花生分子育种领域，具体涉及一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和品质。随着生物技术的发展，利用转基因技术来改进花生栽培种受到研究者的广泛重视。而在花生遗传转化过程中利用抗生素类基因和抗除草剂类基因进行筛选，有可能会对环境及人类健康产生不良影响和损害。因此，利用无争议的生物安全标记基因来构建表达载体，便逐渐成为新的研究热点。木糖是半纤维素的主要组成部分，自然界中存在着某些利用木糖的丝状真菌、酵母菌和细菌，但是许多植物细胞不能利用木糖，所以难以将木糖基因等安全标记基因用于植物中以筛选转化体。

发明内容

针对现有技术中花生遗传转化过程中利用抗生素类基因和抗除草剂类基因进行筛选存在的缺陷和不足，本发明提供了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法。本发明构建了含有xylA基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA，并通过农杆菌介导法转化花生胚小叶外植体，在添加了蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基上进行筛选，诱导成苗率达15.25%，转基因阳性率达到77.27%。本发明避免了利用抗生素筛选可能造成的安全隐患，而且转化效率高，是一种安全、高效的筛选方法。

为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，它包括以下步骤：

(1) 将目的基因插入到含木糖异构酶基因xylA的植物表达载体中，构建含有目的基因的重组载体；

(2) 将重组载体转化花生胚小叶外植体；

(3) 将转化后胚小叶外植体转移到添加有蔗糖和木糖的诱导培养基上进行培养，4~5周后诱导出体胚；

(4) 将体胚转移到添加有蔗糖和木糖的萌发培养基上进行培养，4~5个月后诱导成苗； 

(5) 对再生苗进行PCR检测，获得转基因阳性植株；

(6) 将转基因阳性植株通过嫁接方法移栽田间。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中植物表达载体为pCAMBIA1301-xylA。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中利用农杆菌介导法将重组载体转化花生胚小叶外植体。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(3)中诱导培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、10mg/L 2,4-D的MS-B₅培养基。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(4)中萌发培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、4mg/L BAP的MS-B₅培养基。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(3)和(4)中的培养条件为25℃、3000lx、每日光照13h。

对技术方案的进一步改进：所述步骤 (5)中PCR检测的xylA基因引物为：

上游引物为5ˊ-CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3ˊ，

下游引物为5ˊ-CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3ˊ。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明所述将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，使用添加了蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基进行培养，转化体在木糖异构酶基因xylA的催化下能将木糖转化为木酮糖，再经过磷酸戊糖途径分解代谢，为细胞生长所利用，在以木糖为主要碳源的培养基上，转化细胞因能利用木糖而呈现优势生长，非转化体则因碳源供应不足而使生长受到抑制不能成苗。因此可以筛选出转化体，避免了使用抗生素进行筛选可能造成的安全隐患。

2、在添加蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基进行培养，诱导成苗率达15.25%，所得到的再生植株经PCR检测阳性率高达77.27%，是一种安全、高效的筛选方法。

 

附图说明

图1是本发明中花生胚小叶外植体在添加蔗糖（10g/L）的培养基上的生长情况。

图2是本发明中花生胚小叶外植体在添加蔗糖（5g/L）的培养基上的生长情况。

图3是本发明中转基因植株在添加蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基上筛选后的PCR检测结果。

图4是本发明中转基因再生植株嫁接移栽田间生长情况。