[发明专利]过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法。

背景技术

microRNA是一类长约22个碱基的、广泛存在于动植物体内的内源非编码RNA[1]。近10年来，随着对microRNA研究的不断深入，科学家们已经发现microRNA虽然不编码蛋白，但是，它们可以通过碱基互补配对的方式来识别与之相对应的靶mRNA，通过抑制翻译或是促使靶mRNA降解的方式影响基因表达[2]。microRNA能够参与诸如生长发育、免疫防御等许多生理过程，并且microRNA的调节异常可以参与到多个疾病的病理过程[3，4]。所以，microRNA作为一种新发现的基因表达调控分子有着重要的功能。

过表达所要研究的目的基因，并观察其产生的表型，是探索基因功能的一个不可或缺的方法。对于microRNA，过表达的方式目前主要有：转染人工合成的microRNA类似物或microRNA茎环前体；克隆基因组中的microRNA编码序列到过表达载体中再转染细胞。人工合成的类似物或是前体虽然可以特异性地提高细胞中的某个microRNA的表达，但是，它只能实现瞬时表达，随着细胞的增殖，其过表达水平会被稀释，难以应用到需要长时间稳定表达的研究，更难以实现体内研究。通过质粒过表达的方式，尤其是通过病毒载体进行的过表达，可以实现稳定过表达，并且转染容易，能实现体内功能的研究。

但是，目前的microRNA过表达质粒的构建，依赖于克隆基因组中的microRNA编码序列(通常将pre-microRNA的全部序列同其上下游各一、两百个碱基一并克隆)。每个microRNA基因经过转录、加工，理论上最终都能够产生两种具有不同成熟序列的成熟体microRNA：5p-microRNA和3p-microRNA[5]。在生理条件下，对不同的microRNA，这两种成熟序列会以其中的一种为主进行表达(称为miR-X)，而另外的一种却被淘汰降解丰度很低(称为miR-X^*)；有时则会两种序列共同表达并存在(分别称为miR-X-5p和miR-X-3p)[6]。由于现有的质粒过表达策略是模拟细胞内部的microRNA转录和成熟的过程，而这一过程对成熟体序列有天然的选择性，所以，不能大量地过表达水平低的miR-X^*，也不能随心所欲地单一过表达其中的一条成熟体序列(针对miR-X-5p和miR-X-3p的情况)。

然而，随着研究深入，microRNA的功能不仅局限于早期所鉴定的表达量丰富的成熟体序列，有越来越多的研究表明，原来被认为表达丰度低的成熟体序列，在特定的条件下表达会被上调，进而发挥调节功能[7，8]。同时，由于5p-microRNA和3p-microRNA的序列差异，其功能往往是不同的。

因此，在原有质粒过表达优势的基础上，通过新的策略，单一地过表达microRNA成熟体序列中的一种，势必为今后更精细的研究microRNA的功能提供了一个强有力的工具。

发明内容

本发明的目的在于提供过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法。

在本发明的第一方面，提供一种表达单一microRNA成熟体的方法，所述方法包括：

(1)提供一种表达构建物，所述的表达构建物含有以下结构：

5’Seq_正向-Y-Seq_反向3’    (I)；

其中，Seq_反向为该单一microRNA成熟体相应的DNA序列；Seq_正向为与Seq_反向互补的序列；Y为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；式I所示的结构可形成如下所示的二级结构：

其中，“|”表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸是配对的，在Seq_正向和Seq_反向之间形成氢键；表示在Seq_正向和Seq_反向中，相应的核苷酸不配对；并且，“|”和的分布构成了Seq_反向与Seq_正向的互补；