[发明专利]一种提高杂交种种子纯度鉴定效率的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业的种子纯度检验技术领域，具体涉及提高基于单核苷酸多态性标记（SNP/InDel ）-焦磷酸测序技术检测杂交种纯度鉴定效率的方法，是一种基于DNA池（DNA pooling）技术的pooling数量确定和数据分型在杂交种种子纯度鉴定上的应用。

背景技术

种子纯度鉴定的方法有田间试验形态学标记、同工酶标记、RAPD标记、SSR标记等技术，但以上标记技术在操作性、稳定性、多态性等方面不能满足需要。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有密度高，遗传稳定性好、易自动化分析等优点，已成为继SSR标记之后的新一代遗传学标记技术，近年来被广泛应用于作物分子辅助育种及品种鉴定。Jin-kee Jung等（2010）利用Allele Specific PCR (AS-PCR)从conserved ortholog set II (COSII) markers中筛选出40个辣椒SNP位点，能区分81个商品种子中的79个，能鉴定17个甜辣椒；Wim Deleu等（2009）从甜瓜公共EST数据库发掘SNP标记，鉴定获得45个SNP位点，丰富了甜瓜基因变异图谱，并将SNP标记用于甜瓜品种鉴定。

焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是应用于DNA序列分析的新一代技术工具。在遗传分析中，可以提供核酸序列信息的分子检测技术是“黄金标准”，其权威性比其他DNA分析方法如Northern杂交，基因芯片和实时定量PCR（Taqman探针）技术更好。其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，具有准确性高，重复性好，自动化程度高，操作简单的特点。

焦磷酸测序技术平台能够对目标SNP/InDel标记进行分型和等位基因频率进行分析。

DNA池技术（DNA pooling）是指把多个样本的 DNA按一定比例混合在一起，进行PCR扩增、基因扫描、基因分型等后续实验分析（Sham et a1．，2002），组成DNA池的样本数量从几个到几千个样本不等。DNA池技术多结合DHPLC、Sanger测序等方法用于SNP位点、基因频率分析、基因连锁等研究。DNA池技术在不减小检测效力的前提下提高研究效率，缩短研究周期，节省研究经费，目前已广泛应用于医学、动物、植物等基因研究工作中。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种基于DNA池技术（DNA pooling）的提高杂交种种子纯度鉴定效率的方法。通过数据换算分析，获得种子纯度，提高杂交种纯度鉴定效率3倍。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种提高杂交种种子纯度鉴定效率的方法，其特征在于将3个大小均匀、饱满的种子或其他组织样本进行DNA提取，用于PCR扩增及焦磷酸测序检测SNP/InDel位点的等位基因频率分析；其中基因频率与测试样本中纯度换算数据模型的计算方法如下：

SNP位点等位基因频率换算：Y = -15.427X + 111.44，如图1所示；  

InDel位点等位基因频率换算：Y =-15.141X + 109.33，如图2所示； 

其中Y值为等位基因频率百分数，X值为测试样本中杂交种所占比重。

本发明所述的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）样本前处理：如果为籽粒样本，取3粒大小均匀、饱满的种子，研磨至粉碎，充分混匀，取100-200mg进行DNA提取；如果为叶片组织样本，取3株相同部位叶片，叠加放置，使用适合大小的打孔器打取3个等大小的叶片部分，匀浆混匀，进行DNA提取；

（2）SNP/InDel位点等位基因频率测定换算：针对作物SNP/InDel位点进行PCR扩增，扩增所需引物如序列表NO1-NO8所示；焦磷酸测序检测，在AQ模式下获得该SNP/InDel位点不同基因型的等位基因频率；判断出3株测试样本中的杂交种数量，进而换算成种子纯度。

本发明所述的方法中PCR扩增引物和焦磷酸测序引物依据该作物SNP/InDel位点使用PSQ Assay Designsoftware 进行设计。