[发明专利]一种启动子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种启动子，包括含有此启动子的结构和载体，并涉及此启动子的制备方法。

背景技术

昆虫病原丝状真菌可通过侵染昆虫使其致死，因此，已作为防治昆虫的有效的生物农药。但野生昆虫病原真菌毒力低，致死昆虫时间长。通过基因工程的手段，超表达某些外源或内源毒力基因，可以大大提高病原真菌毒力。但目前昆虫病原真菌中常用的启动基因表达的启动子大都是来自其他动植物病原真菌，目前应用最广泛的是构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(PgpdA)，是多种真菌中外源及内源基因的组成性表达首选的启动子，如人类病原真菌，植物病原真菌及昆虫病原真菌。但是PgpdA的启动效率表现不尽人意。而且，PgpdA长2.2kb，片段较大，不利于基因工程中载体构建。寻找真菌内源的高效率的组成型启动子，一方面可为昆虫病原真菌基因工程研究提供工具，同时也为利用该启动子构建具有高效杀虫活性的昆虫病原真菌奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种启动效率高，易构建的启动子，即PMagpd启动子。

本发明的另一目的在于提供含有上述启动子的表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述启动子的转化载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述启动子的宿主或宿主细胞。

本发明的目的是通过如下措施实现的：

一种启动子，为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或为对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ IDNO：1相同的作为启动子能力的核苷酸序列。

一种启动子，为能在高度严格条件下与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或为能在高度严格条件下与对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO：1相同的作为启动子能力的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

上述启动子，包括表1所述的DNA序列，在所述启动子的位置如表1所述。表1中所示DNA序列是PMagpd启动子中的一些保守序列和反向或正向重复序列，这些序列一般来说是不可取代或缺失，它们的组合发挥着启动效力。

表1

注：大写字母为正向重复，小写字母为反向重复

优选地，上述启动子来源于蝗绿僵菌。更优选地，上述启动子来源于蝗绿僵菌的Magpd基因上游序列。

进一步地，发明人运用基因工程手段将该启动子制成构建体，表达载体，转化载体以利于启动子的后续应用。

一种构建体，含有上述启动子。

一种表达载体，含有上述启动子或构建体。优选地，所述表达载体为pK2-PMagpd-GUS，其物理图谱如图2所示。

一种转化载体，含有上述启动子、构建体或表达载体。

一种转化过的宿主或宿主细胞，含有上述启动子、构建体、表达载体或转化载体。

优选地，上述宿主或宿主细胞是真菌或真菌细胞。更优选地，上述宿主或宿主细胞是昆虫病原丝状真菌。更优选地，上述宿主或宿主细胞是绿僵菌或白僵菌。最优选地，上述宿主或宿主细胞是蝗绿僵菌。

另外，本发明提供了上述启动子的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)菌株CQMa102。

(2)从菌株中提取基因组DNA。

(3)用序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的引物从基因组DNA中扩增所述启动子序列。

优选地，上述启动子的制备方法包括如下步骤：

将蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)菌株，在1/4SDAY液体培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母浸膏5.0g/L，pH值调至6.0)，28℃250rpm振荡培养3天，用真菌基因DNA提取试剂盒提取基因组DNA。根据蝗绿僵菌基因组序列(Genbank登录号ANDI00000000)，获取了Magpd基因组序列(Genbank登录号EFY84384.1)，用引物MgpdF和MgpdR，其序列见SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示，扩增Magpd基因上游的所述启动子序列。

本发明还提供了所述启动子的转化载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将PMagpd启动子与目的基因可操作地连接；