[发明专利]一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法

说明书

技术领域

 本发明属于生物制药工艺领域。具体涉及一种利用微载体技术灌注培养动物细胞生产蛋白的方法。

背景技术

重组蛋白质类药物作为治疗性药物越来越凸显其重要的医用价值和商业价值。一般情况下，较大的、结构较复杂的蛋白质都是采用哺乳动物细胞表达系统来进行生产的。因此，重组蛋白质类药物的高水平生产依赖于哺乳动物细胞的培养工艺的选择与优化。

目前，动物细胞培养工艺繁多，归纳起来有三大类，即贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。

贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由于细胞固定于表面，不需要复杂的细胞截流装置，便于采用灌注培养。然而与悬浮培养相比，贴壁培养扩大培养比较困难，不能有效监测。

悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要由于非贴壁依赖性细胞培养，由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，因此保护细胞免受剪切力伤害是放大培养中一个重要问题。

固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的一种方法。可以说，不同的培养工艺各有其特点。

细胞微载体贴附悬浮培养，是贴壁培养技术的一种。其原理是将对细胞无害的微载体颗粒加入到反应器内的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体贴附悬浮培养兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，是公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，尤其适合工业上有重要价值的贴壁依赖型细胞系，如BHK、CHO等细胞。

然而，利用生物反应器系统进行微载体大规模细胞培养，存在诸多影响因素和限制。其主要限制因素包括细胞对剪切力的敏感性、氧的传递效率以及传代和扩大培养等。

无论是悬浮培养还是贴壁培养，就操作方式而言，可以分为：分批培养（Batch）、连续培养（Continuous）、灌注培养（Perfusion）、以及流加培养（Fed-batch）等，不同操作方式有其不同的特点。分批培养（Batch），一次补料一次收获，操作简便，由于营养成分缺乏和代谢废物的积累，培养时间较短。流加培养（Fed-batch），连续补料一次收获，适时补充营养成分，但是代谢废物积累过多。灌注培养（Perfusion）是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。其优点是可降低代谢废物，细胞密度较高从而较大提高产品的产量。

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，充分利用摇动式反应器传质、传氧效率高、营养物质混合均匀等优点，在此反应器中添加一定量微载体，为贴壁细胞生长提供表面积和微环境，并根据动物细胞生长代谢的特点，采用了优化的灌注培养方式，实现了贴壁细胞的高密度，长时间培养的，从而提高重组蛋白产量。

发明内容

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：该种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，主要包括细胞的接种，起始生长阶段，改变培养条件，后续生长阶段，并在整个周期监测培养条件，即细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析主要过程。具体步骤如下：

1、细胞的接种。

接种的动物细胞应是含有编码重组蛋白质基因及遗传控制元件的载体重组宿主细胞，并且是经过使用常规蛋白质检测方法检测，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、斑点印迹（Dot blot）、高效液相色谱（HPLC）、亲和层析等，并确定具有高效表达的重组宿主细胞。在此所说的哺乳动物细胞包括杂交瘤细胞、重组CHO细胞等半贴壁、贴壁依赖性工程细胞。

表达目的重组蛋白质的宿主细胞得到鉴定后，通过多种方法增殖细胞。复苏的细胞在有限传代次数下，一般经过容积递增的容器逐级扩增，可以使细胞扩增至任何所需细胞密度，再接种至下一中间反应器或者最终生产反应器，接种前细胞应处于一定活率范围之内。并且扩增过程中可辅以使用额外装置、培养物中添加额外化学物质等手段调控某些条件，包括但不局限于pH、温度、溶解氧等，创造利于细胞增殖的环境。

生产用生物反应器的起始细胞接种密度可根据实际情况选定，起始细胞密度可以为约每毫升4×104个至每毫升5×107个活细胞，甚至更高。

接种的细胞也可以稀释至所需的密度以接种于生产用生物反应器，稀释所用溶液可以为与生产所用的相同培养基，也可以为其他培养基。