[发明专利]一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，其特征在于，此生产方法用于细胞培养的反应器，其混合方式为摇动式混合，微载体悬浮存在于反应器中，并处于不间断的流动状态，细胞可长时间、高密度生长于微载体表面，并可持续收获重组蛋白。

2.权利要求1所述的混合方式所使用的反应器为摇动式的反应器，可以是激流式细胞生物反应器，也可以是其他由外在机械带动引起反应器内细胞培养物流动的反应器。

3.权利要求1所述的微载体为大孔的纸片式微载体，其材质可以是一次性聚酯纤维纸片或其它可具有相同功能的材质，其为大小0.5-3.5cm2，形状呈“V”或“W”型折叠，优化的大小及密度利于悬浮，微载体的数量与反应器工作体积的关系为：重量（克）/反应器工作体积（升）=10-20/1。

4.权利要求1所述的一种利用微载体技术灌注培养细胞生产重组蛋白的方法，其生产步骤如下所述：

（1）重组细胞株的培养与扩增，达到起始细胞密度后，接种入含有一定量微载体生物反应器内；

（2）经过静止过程，细胞进入有血清培养液起始生长阶段；

（3）当细胞生长到一定密度的情况下，改变细胞培养条件，使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，并持续收获含重组蛋白培养液并进行纯化分离；

同时在整个培养周期中，定期监测培养条件。

5.根据权利4所述的重组细胞株，其特征是，含有编码多肽或蛋白质基因及遗传控制元件的载体重组宿主细胞，包括CHO、SP20、NS0。

6.根据权利4所述起始细胞接种密度，其特征是，起始细胞密度可以为约每毫升4×104个至每毫升5×107个。

7.根据权利4所述接种后的静止过程，其特征是，接入反应器后，早期处于静止培养，或者低速温和的搅拌，或者间断温和的搅拌，同时使微载体和细胞处于小的体积培养，搅拌速度38-41转/分钟或者根据反应器的体积大小逐渐提升，时间为6-24小时。

8.根据权利4所述将重组细胞株接种入生物反应器这一步骤，其特征是，细胞接种时的体积，开始时低于最终工作体积，是能浸泡微载体及能使微载体均匀搅拌的最小体积。

9.根据权利4所述细胞进入有血清培养液起始生长阶段这一步骤，其特征是，在细胞起始生长开始阶段，其培养体积可以是最终工作体积的几分之一，也可以是最终工作体积，也可以补入培养基，一次性或逐步达到最终工作体积。

10.根据权利4所述的细胞进入有血清培养液起始生长阶段这一步骤，包括如下特征：反应器温度设置37℃，pH为6.9-7.4、溶解氧为30%-80%，搅拌速度为38-56转/分钟，培养时间是3-10天。

11.根据权利4所述的当细胞生长到一定密度的情况下，改变细胞培养条件，其中所述的改变细胞培养条件，选自温度、化学诱导物、重量摩尔渗透压浓度、pH、培养基，及其组合。

12.根据权利11所述的化学诱导物，其所指正丁酸钠，添加的正丁酸钠维持在整个细胞培养物的生产期，浓度在0.5毫摩/升至1.0毫摩/升范围内。

13.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，后续生产阶段采用连续灌注培养法，每天的灌注体积可以是生产反应器工作体积的50%-300%。

14.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，后续生产阶段持续至达到重组蛋白单位体积收获量减低到最大单位体积收获量的1/2-1/4，或者葡萄糖每天的消耗量为最大消耗量1/2-1/4，时间上后续生产阶段维持 10天以上。

15.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，提高搅拌速度至45-56转/分，温度35-37℃，pH为6.8-7.2、溶解氧为20%-70%。

16.根据权利4所述使细胞进入无血清培养液后续生产阶段，其特征是，使用的无血清培养基为商品化的无血清培养基，或者为针对特定克隆株优化的无血清培养基，或者商品化的无血清培养基中添加部分生长因子、抗氧化剂、水解化合物，部分得到优化的培养基。