[发明专利]敲低小鼠内源性CYP3A酶的shRNA分子、重组表达载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及敲低小鼠内源性CYP3A酶的shRNA分子，还涉及含有该shRNA分子的重组表达载体和该重组表达载体的构建方法，也涉及shRNA分子在敲低哺乳动物细胞CYP3A酶中的应用。

背景技术

小鼠是在药代动力学和药效学研究中广泛应用的重要模式动物，是药物研发的重要工具。细胞色素P450酶（Cytochromosome P450，CYP）活性的种间差异是导致药物代谢与药物效应指标不能完全从小鼠等模式动物直接类推到人体的重要原因。通过转基因技术在动物体内表达人CYP酶是克服CYP酶种间差异最直接的手段，但是由于动物内源性CYP酶在组织分布、底物谱、酶活性等方面往往与人体同源酶具备广泛的重叠，导致转入的人CYP酶的活性与功能无法得到充分的体现。因此，在内源性CYP酶表达缺失的动物中转入人CYP酶是克服CYP酶种间差异、研究人CYP酶对特定药物代谢与效应影响的最适途径。常规的基于ES细胞DNA同源重组的基因敲出技术可封闭小鼠内源性CYP酶的表达，但该技术周期长、效率低、成本高，且由于小鼠CYP酶超家族由多个亚家族、数十个成员组成，因此通过常规的基因敲出技术同时封闭多个CYP酶亚家族或多个成员基因表达难道极大。基于shRNA分子的RNA干扰技术为封闭小鼠内源性CYP酶表达提供更简便、低成本的新途径。该技术通过在动物体内表达针对靶基因的shRNA分子即可有效封闭靶基因的表达，无需依赖于基于ES细胞的DNA同源重组。由于同一CYP亚家族成员基因的编码序列之间具备较高的同源性，为通过RNA干扰技术同时封闭多个CYP基因表达提供了方便。3A亚家族P450酶（CYP3A）是人类药物代谢关键酶，参与了50%以上临床用药的I相代谢，因此特异性封闭或消除小鼠内源性CYP3A表达是构建CYP酶人源化转基因动物模型的首要任务。CYP3A11、CYP3A41和CYP3A44是CYP3A亚家族的多肽成员，在小鼠肝内微粒体中优势表达的基因，是参与药物代谢的主要成员。本发明通过分子设计，设计了可同时封闭小鼠CYP3A11、CYP3A41和CYP3A44等三个小鼠CYP3A亚家族重要成员基因表达的shNA分子，以封闭小鼠内源性CYP3A基因表达，为建立CYP3A酶人源化转基因小鼠模型、研究人CYP3A酶功能提供工具。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一在于提供小鼠内源性CYP3A酶的shRNA分子，所述shRNA分子核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明目的之二在于提供敲低小鼠内源性CYP3A酶shRNA分子的重组表达载体，所述重组表达载体含有所述shRNA分子的编码序列，所述shRNA分子的编码序列如SEQ ID No.5所示，表达载体为慢病毒表达载体pPRIME-CMV-GFP-FF3。

本发明目的之三在于提供重组表达载体制备的方法，制备所述shRNA分子的编码序列，然后插入慢病毒表达载体pPRIME-CMV-GFP-FF3，得重组表达载体pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。

进一步，所述制备shRNA分子的编码序列，具体步骤为：以人工合成如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板，以SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4所示序列分别为上、下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃预变性5 分钟；94℃变性30 秒，66℃退火30秒，72℃延长40秒，30个循环；最后72℃延长8 分钟，得shRNA分子的编码序列。

进一步，所述重组表达载体的制备方法，具体步骤为：

将所述制备shRNA分子编码序列用XhoI和EcoRI酶切，同时用XhoI和EcoRI酶切所述慢病毒表达载体pPRIME-CMV-GFP-FF3，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收酶切的shRNA分子的编码序列和慢病毒表达载体pPRIME-CMV-GFP-FF3骨架，然后将回收的shRNA分子的编码序列与慢病毒表达载体pPRIME-CMV-GFP-FF3骨架在T4 DNA酶作用下16℃连接，得重组表达载体pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。

本发明目的之四在于提供所述重组表达载体制备慢病毒颗粒，其特征在于：所述慢病毒颗粒含有重组表达载体pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。

本发明目的之五在于提供所述shRNA分子在敲低哺乳动物细胞CYP3A酶中的应用。

进一步，所述CYP3A酶为CYP3A11酶、CYP3A41酶或CYP3A44酶。

进一步，所述哺乳动物细胞为小鼠肝细胞。