[发明专利]棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法及检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏 颚口线虫的检测方法，具体涉及一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR 检测方法。此外，本发明还涉及用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的 引物。

背景技术

颚口线虫病是因人食入生的或未熟的含有颚口属(Gnathostoma)幼虫的淡水鱼引起的人 畜共患寄生虫病。颚口线虫属有13个有效种，目前已报道的致病种有棘颚口线虫 (G.spinigerum)、刚刺颚口线虫(G.hispidum)、杜氏颚口线虫(G.doloresi)、日本颚口线 虫(G.nipponicum)、马来颚口线虫(G.malaysiae)和双核颚口线虫(G.binucleatum)，因 此，对食品中检出的颚口线虫幼虫虫种的鉴别对该病的诊断与防治有重要意义。颚口线虫种 类的鉴定，传统方法是以形态特征为鉴别指标，但颚口线虫的生活史复杂，不同发育阶段形 态变化较大，有些虫种的第三期幼虫形态相似，传统形态方法很难鉴别，因而不能作为虫种 鉴别的精确指标，且传统方法也费时费力。

PCR技术具有简便、快速、灵敏的优点，目前，该技术已逐渐应用于寄生虫种类的鉴别， 研究的目的基因多以核糖体DNA(rDNA)为主。真核生物rDNA的内转录间隔区(internal  transcribed spacerregion，ITS)包括ITS-1和ITS-2，进化较快，具有种间特异性和种内 保守性，是进行种间分类的极好材料，可设计特异性的引物进行扩增，并比较ITS序列的差 异来鉴定形态学上难以区别的近缘种。将ITS序列用多重PCR方法来鉴别颚口线虫虫种，目 前国内尚无相关报道。棘颚口线虫、杜氏颚口线虫、日本颚口线虫是亚洲最常见的3种颚口 线虫致病种，本发明根据ITS-2序列，分别设计这3种颚口线虫的特异引物，进行多重PCR 扩增，旨在建立一种快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫种类的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多 重PCR检测方法，其不需要繁杂的形态鉴定与测序步骤，就可以同时鉴别棘颚口线虫、日本 颚口线虫、杜氏颚口线虫三种颚口线虫。旨在解决颚口线虫鉴定时耗时、成本高、工作量大 等问题，也为进一步同时鉴定所有13个颚口线虫虫种奠定了基础。该方法的建立可满足进出 口水产品检疫、快速、准确的要求，同时，为我国人畜共患寄生虫病的研究与食品安全防控 上提供一种新的适用方法。为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一方面，提供一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检 测方法，具体步骤包括：

1虫体DNA提取

2引物设计与筛选

3PCR反应条件优化

4单一PCR扩增特异性验证

5多重PCR扩增特异性验证

6PCR敏感性验证

7临床虫种鉴定方法的可行性验证

步骤1中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫DNA提取方法为：从70％ 乙醇保存液中取出单个标准虫种(3株标准虫种已经过形态学和分子生物学鉴定)，置于1.5mL Eppendorf管中，按照QIAGEN公司DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit)使用说 明书提取颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20℃保存备用。

步骤2中，所述的颚口线虫引物设计与筛选具体为：应用DNAstar7.1与Primer5.0等分 子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域， 在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物。筛选确定最终实验所 用的引物，确保所设计引物能特异扩增出对应虫种的目标产物，并且在实施多重PCR过程中， 多对引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构等。最终所确定的引物序列见 表1。

表1多重PCR引物序列